组蛋白乙酰转移酶修饰型人源载体的构建及其功能研究的任务书.docx

组蛋白乙酰转移酶修饰型人源载体的构建及其功能研究的任务书
任务书
一、任务背景
组蛋白乙酰转移酶（histoneacetyltransferase，简称HAT）是一种酶类，能够催化组蛋白上乙酰化修饰的反应，从而影响染色质结构与功能，在表观基因调控中发挥着重要作用。组蛋白乙酰化修饰可以降低染色质紧密包结程度，使得基因转录因子能够去到依赖性的DNA序列并启动转录，还可以招募一些辅助蛋白质，搭建一些表观基因调控复合物，对染色质结构、DNA复制和修复等过程都有影响。
本任务将利用HAT在表观基因调控中的重要机制，构建修饰型人源载体，从而探究HAT对人基因表达的影响以及在免疫疾病等方面的应用前景，研究内容涵盖基因克隆、细胞培养、蛋白表达和功能鉴定等方面。
二、任务目标
1.设计并合成带有HAT修饰基团的修饰型人源载体，实现对人基因表达的调控，为免疫疾病的研究提供潜在工具。
2.利用HAT修饰型人源载体，进行细胞转染、蛋白表达、蛋白纯化等基本技术操作，获取相关实验数据。
3.对HAT对基因表达的影响进行研究，探明其表观基因调控机制，为HAT基因在基础和应用研究中提供理论支持。
三、任务内容
1.设计修饰型人源载体并合成。
（1）根据HAT修饰机制、人源基因序列等信息，设计包含特定基团的修饰型人源载体模板，包括携带融合标签(如6xHis-tag、Flag-tag或Myc-tag等)的载体,以及携带启动子和终止子的载体;
（2）利用PCR、酶切、质粒连接、转化等基本分子生物学技术，构建所设计的修饰型人源载体;
（3）进行质粒鉴定，确认所构建的修饰型人源载体正确。
2.细胞培养和转染。
（1）培养CHO或HEK293等哺乳动物细胞系，维持在恰当的条件下进行，比如控制pH值、温度、CO2浓度等因素;
（2）利用所构建的修饰型人源载体对细胞进行转染操作，通过fluorescenceactivatedcellsorting(FACS)筛选出正常表达HAT基因的细胞群体，提高实验效率。
3.蛋白表达和纯化。
（1）收集经过FACS筛选的正常表达HAT基因的细胞，利用真核表达系统稳定表达HAT蛋白;
（2）纯化HAT蛋白，利用蛋白层析技术纯化表达的HAT蛋白;
（3）对纯化的HAT蛋白进行质量检测、SDS-PAGE电泳分析等.
4.功能鉴定。
（1）构建一组对照组和实验组，对相应细胞和蛋白样品进行研究;
（2）利用qRT-PCR、Westernblotting等多种技术，比较对照组和实验组在基因表达方面的差异;
（3）将差异表达的分子或蛋白鉴定出来，分析其与全基因组中的哪些基因有所联系，从而初步探明HAT对表观遗传水平调控的可行性。
四、任务成果
1.修饰型人源载体的构建方案及所构建的质粒分子图谱。
2.正常表达HAT蛋白的细胞群体，包括FACS筛选和细胞培养过程的数据和图片。
3.HAT蛋白的表达和纯化方案及所纯化的蛋白的电泳数据和质量检测结果。
4.基于HAT蛋白的功能鉴定实验数据，包括差异表达基因或蛋白等实验结果,以及基因功能分析等.
五、参考文献
1.ChenX,etal.（2018）HistoneAcetylation:APotentialNewTargetforthePreventionandTreatmentofInsulinResistance.JDiabetesRes.
2.Zorina-LichtenwalterK,etal.(2019)HistoneAcetyltransferasesandDeacetylases:MolecularandClinicalImplicationstoOrofacialGranulomatosisandChronicInflammatoryDiseases.FrontImmunol.
3.Wang,H,etal.(2020)Reactivationofexpressionthroughhistoneacetylation:apromisingapproachforcancerimmunotherapy.CellMolImmunol.
4.GuoR,etal.(2017)HumanendogenousretrovirusKGagcoassembleswithHIV-1GagandreducesthereleaseefficiencyandinfectivityofHIV-1.JVirol.
5.LaspinaNV.(2018)HistoneAcetyltransferase:AKeytoGeneExpressionControl.IntJMolSci.