微生态制剂对大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌体外拮抗试验.doc

微生态制剂对大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌体外拮抗试验

摘要利用黑龙江省微生物研究所生产菌种乳酸菌和芽孢杆菌，由哈尔滨中科生物工程所生产的微生态活菌中药发酵制剂-杆痢肽，体外观察对大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌的抑制效果；同时给1日龄健康罗曼商品代雏鸡服用杆痢肽，然后人工感染大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌，观察保护率。结果表明，杆痢肽对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌率分别为98.28%和95.91%；对人工感染大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌的保护率分别为90%和83.3%。
关键词微生态、中药、益生素、发酵、活菌、杆痢肽、大肠杆菌、沙门氏菌、抑菌率、保护率。
大肠杆菌和沙门氏菌导致的消化道疾病对养禽业危害严重，由于这两种菌的血清型众多，给疫苗防治带来了困难，抗生素滥用又引起耐药菌株的不断增加，肠道菌群的失调，给治疗带来了更大的困难，同时还造成药物的残留危害人类健康。乳酸菌是动物消化道中的优势菌群，产生的有机酸（如乳酸、丁酸、醋酸等）、双乙酰、过氧化氢、细菌代谢产物等化合物对导致消化道疾病的腐败菌和病原菌具有抑制作用，而成为动物微生态制剂的主要组成菌种。该试验利用哈尔滨中科生物工程有限公司生产的乳酸杆菌和芽孢杆菌制备的活菌中药微生态制剂对鸡白痢沙门氏菌和致病性大肠杆菌在体外进行攻击，观察其抑制效果；同时人工感染大肠杆菌和沙门氏菌观察杆痢肽对鸡的保护效果。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验菌株鸡白痢沙门氏菌（C79-13）和大肠杆菌O78由山东农业大学微生物与免疫学实验室惠赠；乳酸菌和芽孢杆菌由哈尔滨中科生物工程有限公司生产。
1.1.2实验动物1日龄健康罗曼商品代雏鸡购于临沂种鸡场。
1.1.3培养基MRS（Manna,Rogosa,Shape）肉汤培养基的配置分别称取胰蛋白胨5g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，柠檬酸三铵1g，醋酸钠2.5g，硫酸镁0.05g，硫酸锰0.025g，磷酸氢二钠1g，吐温-800.5g，用蒸馏水定ml。用1mol/L的NaOH和Hcl调节至pH=7左右，分装，121℃灭菌15min。营养琼脂、大肠埃希菌选择培养基（麦康凯培养基）、营养肉汤购自杭州微生物试剂公司。
1.2方法
1.2.1杆痢肽的制备：将芽孢杆菌、乳酸杆菌分别接入MRS培养基中厌氧活化培养，作为菌种，然后扩大培养，并将菌液浓度调至108个/ml，两种菌液等量混合再加入发酵中药提取物即得复合菌中药发酵制剂-杆痢肽。
1.2.2抑菌试验大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌分别接入营养肉汤和四硫磺酸钠肉汤活化培养，将菌液浓度调配成108个/ml，分别取菌浓度为108个/ml的乳酸杆菌、芽孢杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌1ml与20ml的MRS培养液混合，37℃烛缸中培养48h，用无菌生理盐水作梯度稀释后，涂布在营养琼脂和各种选择性培养基上，经培养至菌落出现，计数各菌菌落数，同时分别以灭菌生理盐水替代沙门氏菌和大肠杆菌菌液作阴性对照，以灭菌生理盐水替代芽孢杆菌和乳酸杆菌作阳性对照。计菌落数，计算出对鸡白痢沙门氏菌和大肠杆菌的抑制率。
抑制率=（致病菌阳性对照生长菌落数-混合菌生长菌落数）/致病菌阳性对照生长菌落数×100%
1.3杆痢肽对人工感染大肠杆菌、沙门氏菌雏鸡的预防试验
1日龄罗曼商品代雏鸡120只（均为健雏，经粪便检查无大肠杆菌）公母各半，随机分成4组，每组30只，分别标记为A、B、C、D组，分笼饲养；A、B组从1日龄起按每只每天0.5ml的量在饮水中加入杆痢肽，C、D组鸡分别以灭菌生理盐水替代；4日龄时，A、C组鸡每只灌服4×108
个菌的沙门氏菌菌液，B、D组鸡每只灌服4×108个菌的鸡大肠杆菌菌液，每天1次，连攻2d，攻毒后每天观察，记录每组鸡的发病和死亡情况。1周后，试验组A、B组饮水中杆痢肽调整到每只每天1ml，同样要求3h饮完，试验期为30d。
2结果
2.1杆痢肽培养物体外对大肠杆菌和沙门氏菌的拮抗试验结果（表1）
表1杆痢肽对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌结果
菌种阳性对照
菌落个数阴性对照
菌落个数混合菌培养菌落个数抑菌率（%）
杆痢肽沙门氏杆菌03.6×10^106.7×10^9大肠杆菌09.6×10^103.4×10^9沙门氏菌1.1×10^1104.5×10^995.91大肠杆菌5.7×10^1109.8×10^998.28
2.2复合菌制剂对人工感染大肠杆菌和沙门氏菌的预防试验结果（表2）
表2杆痢肽对人工感染大肠杆菌
和沙门氏菌的预防试验结果
组别攻毒鸡数/只阳性鸡数/只阳性率%保护率%A30516.783.3B3031090C30201000D30201000
3讨论
大肠杆菌病和鸡白痢病是常见的鸡消化道传染病，目前此病在各种类型的养鸡场均有不同程度的发生，对于禽类消化道疾病的治疗仍以抗生素为主，但若抗生素使用不当，不仅达不到治疗效果