多重半套式PCR检测细菌16srRNA基因方法的建立.pdf

第37卷第1期青岛大学医学院学报Vol.37,No.1
2001年3月ACTAACADEMIAEMEDICINAEQINGDAOUNIVERSITATISMarch2001

多重半套式PCR检测细菌16srRNA基因
方法的建立

闫志勇1王斌1苏维奇2毕春霞2钱冬萌1李慧3

[摘要]①目的设计并建立多重半套式聚合酶链反应(PCR)快速检测临床标本中感染病原菌DNA方法。
②方法通过对多数病原菌16srRNA基因保守区和变异区序列分析,设计通用引物和革兰阴性菌及革兰阳性菌
的特异性引物分别作为外侧和内侧引物,分两步先后加入同一反应体系中对不同细菌的DNA进行扩增。③结果
金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌经扩增后均有长度为1032bp的DNA片段产生;金黄色葡萄球菌另有一长度为
336bp的特异性产物,大肠埃希菌另有一长度为127bp的特异性产物。④结论该方法可以特异、敏感、快速检测
出临床感染的病原菌。
[关键词]聚合酶链反应;RNA,细菌;基因;诊断,实验室
[中图分类号]R446[文献标识码]A[文章编号]100124047(2001)0120022203

ESTABLISHMENTOFANASSAYTODETECTBACTERIAL16srRNAGENESWITHMUTIPLEXSEMI2NESTEDPCRMETHOD
YANZhiyong,WANGBin,SUWeiqi,etalDepartmentofMedicalMicrobiology,QingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao
266021
[ABSTRACT]ObjectiveTodesignandestablishanewmethodtodectectpathogenicbacteriaDNAinclinicalinfectioussamples
bymutiplexsemi2nestedPCR.MethodsAccordingtotheanalysisofconservativeandvariableregionsinbacterial16srRNAgenes,
wedesigneduniversalprimersforallbacteriaandspecificprimersforgram2positiveandgram2negativebacteria.Allprimerswereadded
successivelyintothesamereactionsystemofatwo2stepPCRassaytoamplifythedifferentbacterialDNA.ResultsBothE.coliandS.
aureusamplifieda1032bpDNAfragment.Inaddtion,specificfragmentsof336bpand127bpwereamplifiedinS.aureusandE.colire2
spectively.ConclusionTheresultsuggeststhatthemultiplexsemi2nestedPCRweestablishedisamoresensitive,specificandrapid
methodforaclinicallaboratroytodetectbacterialpathogenes.
[KEYWORDS]polymerasechainreaction;RNA,bacteria;genes;diagnosis,laboratory

细菌感染的病原学快速、准确诊断一直是实验进行多重半套式PCR扩增,取得了成功,现将结果
室检查的一大难点。目前国内外常用的方法主要为报告如下。
培养法,该法虽然特异性较高,但存在费时、阳性率
1材料与方法
低等不易克服的缺点。一般聚合酶链反应(PCR)只
能针对特定的细菌DNA进行扩增,而临床实际操1.1材料来源
作中不可能用PCR逐一检测每种可能的病原菌,因大肠埃希菌(ATCC11775)和金黄色葡萄球菌
此,使该技术的应用受到了限制。另一方面,对于本(ATCC33589)标准菌株均由中国药品与生物制品
应无菌的组织和体液标本(如血液、脑脊液、膀胱中鉴定所提供。基因组DNA提取试剂盒购自美国
的尿液),只要确定有细菌存在即可断定为感染。我Promega公司,TaqplusDNA聚合酶、4×dNTP,10
们根据这一特点,结合16s细菌核糖体RNA×PCRBuffer等购自加拿大MBI公司,DNAMark2
(rRNA)基因兼有保守性和变异性的特征[1],设计erDL2000G购自大连宝生物工程公司,其他试剂由
出所有细菌的通用引物,以及常见革兰阴性菌、革兰本室自行配制。
阳性菌的特异性引物,分别作为外