细胞凋亡实验.ppt

细胞凋亡与检测方法凋亡(apoptosis)：机体在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序化的死亡过程。
坏死（Necrosis）：各种致病因子，干扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成细胞的意外死亡。

二、细胞坏死与凋亡的比较三、细胞凋亡的生理意义NormalCell（二）、生化改变内源性核酸内切酶的作用五、细胞凋亡的检测方法透射电镜观察荧光显微镜2、DNA片断化检测.3、流式细胞仪检测flowcytometer（一）PI单染判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。
（检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死）（二）Annexinⅴ/PI双染色检测标准：
早期凋亡细胞：Annexinⅴ-FITC(+)；PI(-)；

坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞：
Annexinⅴ-FITC(+)；PI(+)；
机械性坏死及非特异性染色：
Annexinⅴ-FITC(-)；PI(+)；
正常细胞：Annexinⅴ-FITC(-)；PI(-)；C-mycASO
200nmol/L
4、线粒体膜势能的检测亲脂性阳离子荧光探针JC-1以单体形式存在，可发出绿色荧光（527nm），若以多聚体形式存在，可发出红色荧光（590nm）.
JC-1可透过正常细胞膜以单体状态进入胞内，正常健康线粒体的膜电位（△ψ）具有极性，JC-1依赖于△ψ的极性被迅速摄入线粒体内，并形成多聚体，发出红色荧光（590nm，线粒体）和绿色荧光（527nm，胞液）.
而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，线粒体内红光强度减弱（590nm），以单体的形式存在于胞液内而发绿色荧光（527nm）.
因此在双色滤光片下观察，正常细胞为高绿高红，凋亡细胞为高绿低红.正常细胞为高绿高红，5、Caspase-3活性的检测Westernblot分析
caspase-3的活化Caspase3，6，7原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
谢谢！