一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107365684A(43)申请公布日2017.11.21(21)申请号201710576618.6(22)申请日2017.07.14(71)申请人复旦大学地址200082上海市杨浦区邯郸路220号申请人上海速创诊断产品有限公司(72)发明人叶辛方雪恩李新鑫孔继烈(74)专利代理机构上海申新律师事务所31272代理人竺路玲(51)Int.Cl.C12M1/00(2006.01)C12N15/10(2006.01)C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表2页附图2页(54)发明名称一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法(57)摘要本发明涉及一种纸微流控芯片，该纸微流控芯片可以实现将核酸的提取纯化、等温扩增和结果判读整合为一体，其检测全程时间仅需要30分钟，并且不需要泵，离心机或热循环仪等设备，结果以肉眼判读的方式实现。利用该纸微流控芯片检测A群轮状病毒感染标本的最低检测限为103copies/ml，利用48例临床标本验证其灵敏度和特异性达到了100％。本发明所述的微流控芯片具有便捷高效，低成本，检测性能良好等优点，其提取和纯化核酸仅需要5分钟，其可替代传统的核酸提取方法(如磁珠法，核酸提取需1小时)，有效缩短检测时间，本发明所述的纸微流控芯片可以在中心实验室或者床旁进行，可成为检测相关病原体(如A群轮状病毒)的有力工具。CN107365684ACN107365684A权利要求书1/1页1.一种纸微流控芯片，其特征在于，所述纸微流控芯片为玻璃纤维纸片，所述玻璃纤维纸片的中间位置为加样区；其中，所述加样区的直径与玻璃纤维纸片的直径的比值为1:9～1:4。2.根据权利要求1所述的纸微流控芯片，其特征在于，所述玻璃纤维纸片中SiO2的含量为100wt％。3.一种含有如权利要求1～2中任一项所述的纸微流控芯片的试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于检测A群轮状病毒的引物组合物：如SEQIDNO：1所示的F3引物、如SEQIDNO：2所示的B3引物、如SEQIDNO：3所示的FIP引物以及如SEQIDNO：4所示的BIP引物。5.一种基于如权利要求1～2中任一项所述的纸微流控芯片的核酸提取方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1)吸附：将样本与样本裂解液混合后，直接滴加在纸微流控芯片的加样区；步骤2)洗脱：采用洗涤液清洗加样区，进行核酸的提取和纯化。6.根据权利要求5所述的核酸提取方法，其特征在于，所述步骤1)中的样本裂解液为盐酸胍-尿素裂解液，其中盐酸胍的浓度为3～4M，尿素裂解液的浓度为4～6M；所述步骤2)中的洗涤液为75％～85％无水乙醇。7.一种基于如权利要求1～2中任一项所述的纸微流控芯片的等温扩增检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、采用纸微流控芯片进行待测样本的核酸提取；步骤二、配制LAMP反应体系，将步骤一提取的核酸模板加入LAMP反应体系，进行恒温扩增反应；步骤三、结果判读：直接肉眼判读和/或利用核酸扩增曲线进行判读。8.根据权利要求7所述的等温扩增检测方法，其特征在于，所述步骤一的具体操作步骤如下：步骤a)吸附：将样本与样本裂解液混合后，直接滴加在纸微流控芯片的加样区；步骤b)洗脱：采用洗涤液清洗加样区，进行核酸的提取和纯化。9.根据权利要求7所述的等温扩增检测方法，其特征在于，所述步骤二中的LAMP反应体系包括反应缓冲液、BstDNA聚合酶、反转录酶、dNTPs、荧光染料、指示剂和SEQIDNO：1～SEQIDNO：4所示的引物。10.根据权利要求7所述的等温扩增检测方法，其特征在于，所述步骤二中的核酸模板为从纸微流控芯片的加样区的中心处切割的圆片。2CN107365684A说明书1/5页一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法技术领域[0001]本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种纸微流控芯片及其核酸提取方法和等温扩增方法；更具体的说，本发明涉及将该纸微流控芯片应用于A群轮状病毒的快速检测。背景技术[0002]儿童感染性腹泻是一类临床多发病和常见病，严重威胁着儿童的生命健康，常年居于造成儿童病死率的前三位，且在发展中国家该疾病的情况更为严重。造成儿童感染性腹泻的病原体类型十分繁多，其中A群轮状病毒是最常见的病原体，目前用于检测A群轮状病毒的方法主要包括免疫学方法及PCR的方法，这些方法常常需要繁琐的操作程序、较为昂贵的仪器设备以及专业的技术人员，且此类方法易出现假阳性或假阴性结果。[0003]核酸检测作为一种具有高灵敏度及特异性的方法，目前已经广泛应用于疾病的诊断。然而核酸检测的第一步提取核酸仍然需要很