PCR详细讲解.ppt

PCRPCR（PolymeraseChainReaction)技术即聚合酶链式反应，又称DNA体外扩增技术。
1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明，荣获1993年度诺贝尔化学奖。DNA半保留复制的机理；

体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质。PCR扩增体系1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（95℃，30s）。
2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（45～65℃，30s）。
3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（72℃，30～60s）。6理论：2n递增（n为循环次数），如果扩增30循环，目标DNA可增加230也就是109倍。
实际：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。

PCR扩增曲线PCR扩增条件PCR反应条件

94℃5min
94℃30s
56.2℃30s
72℃30s
72℃7min
4℃∞
1.避免PCR试剂的污染
2.最适合的反应条件
3.设置对照组：
①PCR空白对照：在反应体系中剔除反应模板。
②PCR阴性对照：即反应体系中用无关的基因片段代替目的模板。
③PCR阳性对照：即反应体系中以已知能够成功进行特异性扩增的模板。1.为什么完全没有PCR扩增产物？
①试剂质量问题或者加样时出错，导致反应体系不完整。
②聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。
③PCR仪温度控制不精确。
④模板DNA发生降解。
⑤引物或反应温度设计不合理
⑥靶片段GC含量过高或扩增对象长2.为什么出现多条非特异性条带？
①反应体系被污染。
②引物特异性差。
③退火温度不合适。3.为什么PCR产物很少？
①聚合酶活性过低。
②循环次数偏低。
③模板DNA浓度过低。
4.为什么PCR产物出现片状拖尾？
①DNA聚合酶过多或酶活性差。
②dNTP和Mg2+浓度过高。
③退火温度过低，PCR循环数偏多。
④模板DNA用量过大或模板DNA不纯。
⑤引物特异性差、引物间形成二聚体导致非特异扩增。
普通PCR仪实时荧光定量PCR仪引物设计为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物是PCR特异性反应的关键，同时也与PCR扩增的效率密切相关。
引物设计的最重要的原则：最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70%或有连续8个互补碱基。
NCBIPrimerBLAST
2、避开易形成二级结构的模板序列区域。
分子内互补、发夹结构、分子间互补。
二级结构会增加引物与模板杂交以及PCR的困难，因此要尽可能避开这种序列区域。
用有关软件预测mRNA的稳定二级结构。293、引物长度一般为18-30个碱基之间。
引物长度与反应的特异性和解链温度成正相关。
过短：扩增特异性下降
过长：引物自身形成二级结构，以及引物二聚体。4、G+C含量一般为40%-60%
引物的碱基组成也会对引物的解链温度产生影响。
G+C含量过低：引物解链温度低，引物易于从模板上解离。
G+C含量过高：引物解链温度高，易与非特异性序列杂交，出现非特异性扩增条带。5、Tm值之差应小于1℃，最适退火温度在55-60℃。
一对引物的Tm值差过大可直接导致PCR扩增效率下降或失败。
对于20bp左右的引物：
Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）
一般情况下，PCR的最佳退火温度比引物Tm值低5℃左右。6、引物中四种碱基最好是随机分布的
避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否则会使引物在G+C富集序列区域产生错配，降低扩增的特异性。7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身互补——发夹结构
引物之间互补——二聚体
引物自身连续互补碱基不应超过3个，引物之间连续互补碱基不应超过4个，尤其避免3’端的互补重叠。8、引物的5’端可以修饰，3’端不可以修饰。
引物的5’端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生物素、引入点突变等。
由于延伸是从3’端开始的，所以不能进行任何修饰。9、引物的3’端不可以A结尾。
引物3’端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3’端最好选择T。10、引物3’端要避开密码子的第3位。
如扩增序列位于基因编码区域，引物3’端