叶片叶绿素含量的测定.doc

植物叶片中叶绿素含量测定----丙酮提取法

1、原理
叶绿素a、b在长波的最大吸收峰分别在663nm、645nm，据Lamber-Beer定律，可得浓度C与光密度D间的关系式：

D663=82.04Ca+9.27Cb
D645=16.75Ca+45.6Cb(浓度单位：g/mL）

叶绿素a的浓度：Ca=12.72D663–2.59D645
叶绿素b的浓度：Cb=22.88D645–4.68D663
总叶绿素的浓度：Ct=20.29D645+8.02D663(浓度单位：mg/L）
2、试剂与材料
2.1试剂：
丙酮、石英砂、碳酸钙
2.2材料：
新鲜叶片。
2.3仪器与器皿：
分光光度计、天平、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管
3、实验步骤
称1.25g叶用丙酮研磨
↓
匀浆过滤（用80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液）
↓
滤液用80%丙酮定容至25mL
↓
适当稀释后测A645、A663
3.1取样：称取1.25g剪碎的叶片（提供的样品即为剪碎后冻于-80℃的叶片）放入研钵中。注意取样时要避开大的叶脉。
3.2研磨提取：向研钵中加入80%丙酮2.5ml，以及少许（约0.002g）CaCO3(中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素)和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止3~5min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。
3.3读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。将比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有80%丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645nm处，以80%丙酮做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述2个波长下的吸光度。每个样品重复测定3次。注意，每次在转换波长时，都要用80%丙酮调透光率100%。
4、结果计算
总叶绿素的浓度：Ct=20.29D645+8.02D663(浓度单位：mg/L）
叶绿素含量：Chl(mg/g叶)=Ct(mg/L)×提取液总量（L）×稀释倍数/材料鲜重（g）