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Westernblot实验技术定义:WesternBlot基本原理WesternBlot一般流程通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。 细胞裂解液:0.5ml水+0.5ml裂解液+10μl蛋白酶抑制剂+10μl泛酸钠+1μlpepstain 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、 丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 细胞数量达5×106个时就可以做WB。 将细胞裂解液再离心,收集上清液 测蛋白浓度(Bca法),统一上样量 加loadingBUFFER煮样5min-10min SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳8纯净水(ddH2O) 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 (Arc-Bis) SDS Tris-HCL 四甲基乙二胺(TEMED)(催化硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合) 过硫酸铵(APS)(提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基) 凝胶浓度与蛋白分离范围SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项:转膜膜的选择转膜转膜注意事项(一)转膜的注意事项(二)封闭(1h)(封闭时间过短会导致背景过深)一抗、二抗孵育显色反应抗体保存注意事项:WesternBlot常见问题分析SDS-PAGE电泳条带比正常的窄? “微笑”或“倒微笑”条带?转膜及抗体检测背景太高