一种酸性蛋白酶高产菌株及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109251867A(43)申请公布日2019.01.22(21)申请号201810793554.X(22)申请日2018.07.18(83)生物保藏信息CCTCCNO:M20183902018.06.21(71)申请人青岛蔚蓝生物集团有限公司地址266061山东省青岛市崂山区苗岭路29号山东高速大厦12A07(72)发明人徐晓东李瑞王贵斌黄亦钧(74)专利代理机构青岛海昊知识产权事务所有限公司37201代理人曾庆国(51)Int.Cl.C12N1/15(2006.01)C12N15/80(2006.01)权利要求书1页说明书6页C12R1/885(2006.01)序列表3页附图2页(54)发明名称一种酸性蛋白酶高产菌株及其应用(57)摘要本发明涉及一种里氏木霉突变菌株，保藏编号为CCTCCNO:M2018390。所述突变菌株是通过多轮紫外诱变筛选获得的，可大幅度提高酸性蛋白酶的产量，20L罐发酵160h后，所述突变菌株发酵上清液中酸性蛋白酶酶活高达51352u/ml，比出发菌提高了36％，取得了意料不到的技术效果。所述里氏木霉菌株可广泛应用于酸性蛋白酶的生产，从而有利于降低酸性蛋白酶的生产成本，促进其在酒精加工和饲料等领域中的推广与应用。CN109251867ACN109251867A权利要求书1/1页1.一种里氏木霉工程菌株，其特征在于，所述的里氏木霉工程菌株转化/转染有用于重组表达酸性蛋白酶基因的重组质粒。2.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌株，其特征在于，所述的酸性蛋白酶，其氨基酸序列为SEQIDNO:1。3.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌株，其特征在于，所述的酸性蛋白酶，其编码核苷酸序列为SEQIDNO:2。4.一种里氏木霉突变菌株，其特征在于，所述的里氏木霉突变菌株的保藏编号为CCTCCNO:M2018390。5.权利要求1所述的里氏木霉工程菌株在生产酸性蛋白酶中的应用。6.权利要求4所述的里氏木霉突变菌株在生产酸性蛋白酶中的应用。2CN109251867A说明书1/6页一种酸性蛋白酶高产菌株及其应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程技术领域，具体内容涉及一种酸性蛋白酶高产菌株及其应用。背景技术[0002]酸性蛋白酶是一类最适作用pH值为2.5～5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000～40000，等电点为3.0～5.0，可广泛应用于食品、饲料加工以及医药等领域。酸性蛋白酶在白酒酿造中起着重要的作用。在以玉米为原料生产白酒时，发酵过程中添加一定量的酸性蛋白酶，使原料中的蛋白质降解，同时破坏原料细胞壁结构，有利于糖化酶的利用；使原料中糖含量增加，有利于提高出酒率。另一方面,通过酸性蛋白酶的作用，原料中的有机氮含量也增加了，有利于酵母的生长繁殖，从而有利于酵母菌的产酒能力，缩短发酵时间，降低成本。此外，添加酸性蛋白酶还可以增加白酒的香味，酸性蛋白酶在酿酒的酸性环境下，将原料中的蛋白质水解成氨基酸，氨基酸在酶的作用下进一步转化成醇、酯、酚等物质，使白酒具有特有的白酒香气。[0003]此外，产业规模化养殖畜禽水产，尤其是养殖中的幼年饲养动物，因其消化器官分泌的酶系和酶量(内源酶)不足，对饲料蛋白质消化能力较差，极易引起消化不良、腹泻与消瘦等疾病。经研究发现，通过在饲料中添加酸性蛋白酶有利于提高蛋白质的可消化性，使蛋白质降解成利于幼年动物消化吸收的氨基酸和多肽，从而有利于动物的生长发育，缩短育肥时间。[0004]目前酸性蛋白酶大都来源于微生物、动物和植物中也有不少。产酸性蛋白酶的微生物主要有黑曲霉、米曲霉、斋藤曲霉、泡盛酒曲霉、宇佐美曲霉、微小毛霉、青霉、根霉等以及它们的变异株、突变株。此外，中华根霉、陆生酵母中如酿酒酵母、白色假丝酵母、扣囊覆膜酵母等也分泌酸性蛋白酶。与动物蛋白酶和植物蛋白酶相比，微生物酸性蛋白酶的一个显著特点是具有多样性和复杂性，通常一株菌株可以分泌一种或多种酸性蛋白酶。[0005]我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白。近年来国内在酸性蛋白酶上的研究大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，已经商品化的酸性蛋白酶生产菌主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和米曲霉等为数不多的菌株。目前酸性蛋白酶生产菌株的产酶量仍不是很高，导致该酶的生产成本居高不下，也在一定程度上限制了酸性蛋白酶的广泛应用。发明内容[0006]本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产酸性蛋白酶的里氏木霉(Trichodermareesei)菌株。申请人首先构建得到重组表达酸性蛋白酶的里氏木霉工程菌株，然后通过紫外诱变的方法筛选获得一