蛋白组学定量蛋白质组学-ppt课件.ppt

蛋白质组学第四章定量蛋白质组学Quantitativeproteomics蛋白质组学的研究目的是以大规模的尺度研究细胞蛋白质的功能。

依靠2-DE和质谱技术，蛋白质组的研究策略和方法在细胞蛋白质的鉴定上已经比较成熟。

但是仅仅进行鉴定并不能提供用以阐明蛋白质的功能的全部信息，监控蛋白质的表达水平对阐明细胞体内存在的各种生物进程是非常重要的。因此，定量蛋白质组学作为蛋白质组学研究的重要一部分被提出来。常用研究方法化学标记定量标记方法（一）体内代谢标记方法酿酒酵母G1细胞周期蛋白Cln2的影响：体内代谢标记法具有较好的稳定性和重复性15N体内代谢标记也可以定量位点特异的化学修饰特点（二）稳定同位素标记的必需氨基酸体内标记(SILAC法)SILAC法:鼠肌肉细胞分化过程中蛋白表达量变化Leu-d3可被细胞吸收肽段：VAPEEHPVLLTEAPLNPK，带3个电荷3-磷酸-甘油醛-脱氢酶表达变化用Lys来标记明显好于其他的必需氨基酸，
因为当用胰蛋白酶(Trypsin)酶切时，
保证了含有Lys残基的每个肽段都只含有一个标记物
避免了未知肽段用15N标记所带来的质量变化不清的类似问题
有利于蛋白质做MS/MS鉴定时质谱图的解析体内标记和体外标记比较体外标记常用方法－NH2标记（d0/d3、d0/d4法）MALDI-TOF/MS分析N末端乙酰化肽段MALDI-TOF/MS分析N末端和Arg的NH2乙酰化肽段E.coli半乳糖苷酶蛋白水平d0/d4标记蛋白质N末端原理MALDI-TOFmassspectrumofapeptidelabeledwithsuccinicanhydrideanddeuteratedsuccinicanhydrided0/d4修饰N末端NH2或ε-NH2依赖反应条件d0/d4标记用于分析蛋白质表达相对量E.coli在完全培养基和条件限制培养基中的蛋白表达比较d0/d4标记37＃点，进行MS分析Lys上-NH2特异标记方法：MCATMCAT策略流程：定性MCAT策略流程：定量酵母细胞提取物的离子层析和LC/MS图谱：定性分析肽段的定量分析MCAT优点–COOH羧基标记羧基酯化标记进行蛋白定量研究–COOH羧基标记这类蛋白水解酶只在肽段的-COOH端引入二个18O标记后的肽段在质谱上的分离18O进行蛋白质组的标记和定量-SH在标记反应中的作用d0/d8法（ICAT方法）同位素标记的亲和标签方法(Isotope–CodeAffinityTag)reactivegroupX=Hydrogen(light)orDeuterium(heavy)ICATlabeledpeptide
+otherpeptidesICATlabeledpeptideICAT方法操作步骤5354ICAT策略优点ICAT方法的缺点二、荧光差示双向凝胶电泳技术
(F-2D-DIGE)蛋白质染色要求F－2D－DIGE技术是在传统双向凝胶电泳基础上发展起来的定量分析凝胶上蛋白质点的新方法。
运用不同的荧光染料分别标记不同的蛋白质，然后将它们等量混合，在单一的2D胶上进行分离和鉴定，按照它们所发出的荧光强度差异，来比较蛋白质量的变化。
其优点是可以在同一块凝胶上比较两种不同来源或不同处理的蛋白质组表达谱，能比较精确地在较宽的动态范围内对研究者感兴趣的蛋白质定量，因此成为一种有较好应用前景的定量蛋白质组学研究方法。原理Introductionof2D-DIGEFlowchartofDIGEanalysisofprocurednormalcellsandcancercellsfromthesametumorsample.
二维电泳荧光检测DIGEgelimagesofnormalandcancercells.A,Cy2imageofproteinsfromnormalcells;B,Cy5imageofproteinsfromtumorcells染料注意事项