曼氏无针乌贼Toll样受体基因及其免疫防御功能.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109868277A(43)申请公布日2019.06.11(21)申请号201910189399.5(22)申请日2019.03.13(71)申请人浙江海洋大学地址316000浙江省舟山市普陀海洋科技产业园普陀展茅晓辉工业区c2—10地块(72)发明人刘慧慧霍利平迟长凤黄伟(74)专利代理机构杭州浙科专利事务所(普通合伙)33213代理人吴秉中(51)Int.Cl.C12N15/12(2006.01)C12N15/10(2006.01)C07K14/705(2006.01)C07K14/435(2006.01)权利要求书1页说明书10页序列表2页附图11页(54)发明名称曼氏无针乌贼Toll样受体基因及其免疫防御功能(57)摘要本发明公开了曼氏无针乌贼Toll样受体基因及其免疫防御功能，Toll样受体基因采用同源克隆法与RACE技术克隆获得，包括如下步骤：1）将提取的总RNA反转录合成cDNA模板，扩增TLR基因片段；2）采用RACE技术以提取的总RNA模板进行目的基因第一链cDNA的合成，然后进行第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，测序；3）将所得的基因序列拼接验证，即得Toll样受体基因。并提供一种该Toll样受体基因在曼氏无针乌贼免疫防御功能中的用途。本发明Toll样受体基因的氨基酸残基中有高度保守的结构域；该Toll样受体基因参与曼氏无针乌贼的天然免疫应答，在其抵御水产病原菌的侵染过程中发挥重要作用。CN109868277ACN109868277A权利要求书1/1页1.曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述Toll样受体基因采用同源克隆法与RACE技术克隆获得，包括如下步骤：1）将提取的总RNA反转录合成cDNA，以所述cDNA为模板扩增TLR基因片段；2）采用RACE技术以提取的总RNA模板进行目的基因第一链cDNA的合成，然后进行第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，测序；3）将步骤1和步骤2所得的基因序列信息，用Lasergene软件进行拼接验证，即可得TLR目的基因cDNA全长信息，即为Toll样受体基因。2.根据权利要求1所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述TLR基因片段克隆用引物为：TLR–F：5'-GTCCCAAACAGTGCGAAT-3'；TLR–R：5'-GCGACAAGTCCAATACCG-3'。3.根据权利要求1所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述cDNA全长克隆用引物为：TLR5’-1：5'-GGACAGTGGTGTAACG-3'；TLR5’-2：5'-GCGAGAAGACGCTGAAGTTG-3'；TLR5’-3：5'-GAGCCATGCTGTCGTTGA-3'；TLR3’-1：5'-TGGAAGCAGATCAACTTGAGTCAGGT-3'。4.根据权利要求1所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述Toll样受体基因cDNA序列全长3914bp。5.根据权利要求1所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述Toll样受体基因cDNA序列包括185bp的5’UTR、137bp的3’UTR及3582bp的开放阅读框。6.根据权利要求1所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述Toll样受体基因cDNA序列编码1193个氨基酸，在多聚腺苷酸化信号下游13bp出现终止密码子，理论分子量为137.87K，等电点为6.69。7.根据权利要求6所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述Toll样受体基因cDNA序列编码的氨基酸的N末端含有信号肽序列，位于1-26aa处。8.根据权利要求6所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述Toll样受体基因cDNA序列编码的氨基酸在989-1026氨基酸处含有1个跨膜区，所述氨基酸序列中包含11个亮氨酸重复序列、1个C端亮氨酸富集区和1个N端亮氨酸富集区。9.权利要求1-8任一项所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因的接头分子，其特征在于：所述接头分子为MyD88，所述MyD88采用同源克隆法与RACE技术克隆获得，所述MyD88基因cDNA序列全长1912bp，其ORF框包含1017bp，编码338个氨基酸的小分子蛋白。10.权利要求1-8任一项所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因的用途，其特征在于：所述Toll样受体基因在曼氏无针乌贼免疫防御功能中的用途；所述免疫防御功能包括调节先天免疫维护机体的健康与进化。2CN109868277A说明书1/10页曼氏无针乌贼Toll样受体基因及其免疫防御功能技术领域[0001]本发明涉及生物科学技术领域，尤其是涉及曼氏无针乌贼Toll样受体基因及其