精子形态学分析.doc

精子形态学分析正常形态精子百分率是评价精子受精能力的重要指标之一。目前，用于精子形态学分析的染色方法有：改良巴氏染色法、苏木精-伊红（HE）染色法、瑞氏染色法、瑞-吉氏染色法、Diff-Quik染色法和Shorr染色法。1涂片的制备一般用新鲜的液化精液或生理盐水洗涤过的精子悬液进行涂片，通常每份标本涂双份片子，以备染色或操作出问题。载玻片应洁净，可用70%酒精洗涤并干燥后使用；涂片的厚薄应根据精子密度而定，精子密度高者涂片应薄些，而精子密度低者涂片应尽可能厚些。涂片的方法有多种，WHO推荐的方法有拉薄技术和滴管法，拉薄技术即用另一张载玻片的边缘拖拉载玻片上的一滴精液；滴管法即水平持滴管使一滴精液沿载玻片的表面展开。由于精液有一定粘稠度，这两种方法都很难涂成均匀的涂片。可建议用以下方法涂片：用滴管将一滴精液置于载玻片上，然后从液滴中央向周围循环吸净多余的精液，注意滴管的头要平整，滴管与载玻片垂直，缓慢吸去多余的液体。低密度、粘稠的、或充满碎屑的标本，建议先离心去除精浆，沉淀的精子团重新悬浮在适当体积中，以获得尽可能高的密度，但不应超过80×106/ml。正常精子密度且液化良好的精液标本亦可以洗涤后用精子悬液进行涂片，但离心操作对精子形态分析有无影响，尚需要进一步验证。精子涂片可进行空气干燥并固定。固定程序取决于染色方法。2改良巴氏染色法这是WHO手册推荐的方法。它可以使精子和其他细胞很好地染色，可使精子头部的顶体和顶体后区、胞浆小滴、中段和尾部着色。染液中的俾士麦棕为盐基性染料，伊红、亮绿、橙黄等为酸性染料，能与细胞中具有相反电荷的蛋白质结合，而染成各种不同的颜色，从而能清楚地区分各种细胞成分。以往用巴氏染色法进行染色时，操作步骤繁琐，目前已有改良的单一的巴氏染色液出售，操作非常简单，只需在自然干燥的精子涂片上滴加1~2滴巴氏染液，染15分钟即可。流水冲洗后自然晾干，显微镜油镜下观察精子形态。3HE染色带正电荷的碱性染料苏木素能与细胞核中带负电荷的核酸结合而使核染成紫蓝色，伊红为酸性染料，能与细胞质中具有相反电荷的蛋白质结合，使胞质呈红色。HE染色为医院病理科的常用染色方法，操作比较繁琐，对于可以借助病理科染色的医疗单位可以选用此法对精子进行染色。4瑞氏和瑞-吉氏染色法瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料，细胞染色后可用于观察内部结构；吉氏染料是由天青、伊红组成的染料，天青对细胞核着色较好，结构显示更清晰。因此，瑞-吉氏染色法比瑞氏染色法效果稍好些，两种染液均可自行配制或购买，操作都比较简单。①瑞氏染液：取瑞氏染料0.1g放入清洁干燥的研钵中，边加少量甲醇边磨至染料完全溶解，加甲醇到60ml，倒入棕色瓶中，室温下放置1周以后即可用。②Giemsa染液：取Giemsa染料0.5g，置于33ml甘油中，60℃水浴2小时，使其溶解，再加入60℃预热的甲醇33ml，混匀后置棕色瓶中，室温下放置数周后方能使用（最好放置半年以上）。③30.1mol/LpH6.9磷酸盐缓冲液：称取NaH2PO42H2O1.4g、Na2HPO412H2O3.94g，加蒸馏水至100ml。染色时，将单独瑞氏染液或瑞氏∶吉氏（10∶1）混合染液滴加于精子涂片上，静置10秒后，滴加等量pH6.9磷酸盐缓冲液，染色10分钟后自来水冲洗，自然干燥，置于油镜下观察。5Shorr染色法精子涂片空气干燥后，用苏木精染色1~2分钟；流水浸洗后置42℃温水中蓝化5分钟（或浸入乙醇铵中蓝化）；Shorr染剂（BDHShorr粉4g溶于220ml50%温乙醇中，冷却，加入

2.0ml冰醋酸，过滤即可）染3~5分钟；流水冲洗，晾干后镜检。6Diff-Quik染色法精子涂片先置于固定液（1.8mg二芳基甲烷加至1L甲醇中而成）中固定5分钟；将玻片直立于吸水纸上以去除多余的液体；将玻片在溶液1（1g氧甲蒽加至1L叠氮钠防腐液中）中染色10秒钟，然后在溶液2（0.625g天蓝A和0.625g亚甲基蓝加至1L缓冲液中）中染色5秒钟，各步骤之间均除去多余的液体；在流水中浸洗10~15次以除去多余的染料；将玻片垂直竖立以去除水分，使之完全干燥；显微镜下观察。7六种染色方法的评价目前使用的精子形态学分析的6种方法，对精子头大小的影响不同，瑞-吉氏和瑞氏染色法的精子头的长轴和短轴最高，其次为Diff-Quik染色法，它们均显著高于其他三种染色方法，可能与精子头发生肿胀有关；巴氏染色法的精子头的长轴和短轴最低，而HE和Shorr染色法的精子头长轴和短轴介于巴氏染色法和Diff-Quik染色法之间。不同染色方法对精子头大小产生显著影响的原因尚不清楚，可能与不同化学物质的特性和不同染色液的渗透压等有关。6种精子染色方法的染色效果亦不同，Diff-Quik和Shorr染色法可以很清楚地区分顶