酪蛋白磷酸肽CPPs的制备.ppt

将酪蛋白配成一定浓度的溶液后，用2mol／L的NaOH调至pH8.3左右，加人一定量的胰蛋白酶进行水解，水解过程始终保持溶液pH在7.7～8.5之间，终止水解时加人1mol／LHcl使溶液pH达4.6．然后离心除去沉淀，在上清液中加人10mL
CaC12溶液至终浓度为100mmol／L，再加入等体积的乙醇，离心收集沉淀，最后将沉淀用丙酮、乙醚洗涤后挥发干燥，即得CPPs的复杂混合物RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基键合硅胶，典型的流动相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离。反相色谱法适于分离非极性、极性或离子型化合物，大部分的分析任务皆由反相色谱法完成。取不同体积的样品进行试验，考察进样量对于分离的影响。当进样体积为200--300μL时，样品能达到较好的分离采用选择性更高的乙酸铵洗脱液代替三氟乙酸洗脱液，对a1、a2、a3收集液再进行第二次分离。阴离子树脂纯化CPP阳离子树脂纯化CPP
原理：CPP在一定pH下带负电,而NPP带正电.将一定浓度的CPP进样,带正电的NPP被吸附于阳离子树脂上,用清水将未被吸附的CPP洗出,得到CPP洗脱液.用阴离子树脂纯化CPP,虽然达到了较好的分离效果,但从工业化规模生产CPP高纯品的角度来看,采用该法也有不
足之处:
1)树脂在使用前和再生时需转型处理,能耗费
用较大,生产效率降低.
2)总的分离时间较长,且操作分为两步,不利
于扩大生产.
3)洗脱时使用的是一定浓度的HCl,使最终产
品带入了一定的盐分.
4)从柱中洗脱下来的CPP溶液浓度很低,后
期浓缩干燥能耗费用较大使用阳离子树脂纯化CPP有如下优点:
1)阳离子树脂使用前无需转型处理.
2)用阳树离子树脂纯化洗脱CPP只需一步,总操作时间只有采用阴离子树脂时的一半.
3)用阳离子树脂纯化时洗脱用的是清水,未带入盐分.
4)从交换容量的角度来看,在确保r(N/P)<5.5的前提下,还可通过提高进样浓度来进一步提高得率,这样洗脱液中CPP的浓度就可以提高,减
少了后面浓缩和干燥的费用CPPs是多种短肽的混合钧，其中大部分肽中含有成簇的磷酸丝氨酸序列(-Serp—Serp-Serp-Glu-Glu-)，这一序列也正是CPPs的功能基团，其含量的多少与CPPs功能特性直接相关．因此，肽链较短，磷酸丝氨酸基团较多的CPPs其持钙能力最强．而cPPs中磷和氮含量的比值(P／N)能较客观地反映CPPs链长和磷酸基的密度，可作为评价CPPs产品特性的重要指标。