难以标准化和自动化细胞代谢活性测定方法3H.ppt

是由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的高活性、多功能、小分子多肽第一节生物学测定方法基于DNA检测的分子生物学测定法：
DNA扩增法
RNA印迹法
原位杂交法
核酸酶保护分析生物活性测定法根据细胞因子对特定的生物学活性,应用相应的指示系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中细胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示直接计数法
简便、直观、费时、主观因素影响大、难以标准化和自动化
细胞代谢活性测定方法
3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT
细胞代谢产物测定法
代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标记或可溶性分子测定法通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3H/125I），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。常见细胞因子3H-TdR掺入检测法所需细胞及参考试验条件特点：不使用放射性核素，
以细胞代谢变化为增殖指征
指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关细胞株/原代细胞二、细胞毒活性测定法三、抗病毒活性测定法TNF-α和TNF-β与同一受体结合，故两者生物学活性相似
用TNF-α与TNF-β特异性中和抗体作阻断试验，以区别两类TNF
TNF活性测定靶细胞：小鼠成纤维细胞株L929、L-M、WEHI164.13
注意：
若选用L929细胞，其不宜生长过密。
细胞被某种因素激活后，代谢增强，线粒体脱氢酶活性也增强，着色也会加深，
MTT染色时，必须考虑待检样品中有无激活靶细胞的因素三、抗病毒活性测定法四、趋化活性测定法五、生物学活性测定方法学评价第二节免疫学测定法免疫学测定原理ELISA法根据抗体性质和特异性不同
可有以下几种不同的夹心法ELISA
1.PcAb与McAb夹心法
2.McAb与PcAb夹心法
3.双McAb夹心法
4.细胞、McAb夹心法流式细胞分析法酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot)免疫学测定方法学评价免疫学测定方法学评价第三节
细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用特定疾病的辅助诊断

机体免疫状态的评估

临床疾病治疗效果的监测和指导用药

疾病预防一、临床应用原则细胞因子的检测方法多种多样，各有利弊。
高敏感性方法：特异性的降低、废弃物难处理
活性测定方法：定性试验
基因分析法：利于细胞内定位分析、操作烦琐常用的临床标本：抗凝全血，并分离获得单个核细胞
炎症局部细胞因子的水平：局部分泌液
细胞因子或粘附分子的细胞内定位检测：相应细胞
相应细胞因子的基因和mRNA表达：相应细胞
疗效观察和预后判断：疾病急性期和恢复期双份标本进行动态观测
免疫荧光染色和流式细胞分析：注意待检细胞的活性和状态，以保证结果的特异性意义：
细胞因子具有网络调节的状调节的特点
级联效应或相互抑制作用的网络系统。
有助于提供有效的疾病诊断和机体免疫状态信息
举例：
T细胞、巨噬细胞和上皮样细胞分泌相应细胞因子的功能：IL-1、IL-2、IFN-γ和GM-CSF
Th1/Th2细胞平衡状态：IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ二、特定疾病诊断的辅助指标三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后