细胞工程实验-植物愈伤组织诱导培养基的配制.doc

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实验一植物愈伤组织诱导培养基的配制
一、实验目的
掌握培养基的配制，灭菌等基本实验操作技术。
二、实验原理
培养基是离体培养组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供的近似生物体内生存的营养环境。完善的植物培养基配方为水、无机营养成分、有机营养成分、生长调节物质还有琼脂。MS培养基是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。和其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。
三、主要仪器与试剂
1.实验仪器：搪瓷杯、玻璃棒、量筒、移液管、加样器、移液枪、电子天平、药匙、称量纸、电热炉、pH试纸、三角培养瓶、试剂瓶、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、镊子、解剖刀
2.实验试剂：琼脂、蔗糖、各类MS母液、2,4-D、HCl、NaOH、三蒸水
四、实验步骤
1.按照配方配制培养基时,先将储存母液按顺序摆放好，根据欲配制的总体积，量取各种不同体积的母液，加入搪瓷杯中，并加入1mL2，4-D后，加入三蒸水至大约400ml。
2.称取15g蔗糖加入搪瓷杯中，调节pH至5.7-5.8。
3.加入琼脂4.5g，加热搅拌溶解，沸腾后立即端离火源，分装在100ml的三角培养瓶中拧紧瓶盖。
4.取一个试剂瓶，加入适量去离子水。
5.将配置好的培养基、装有去离子水的试剂瓶以及一个空试剂瓶、培养皿、镊子、解剖刀放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，备用。
五、实验结果
MS培养基配制完成。植物组织培养前期准备完成。
六、思考题
1.培养基配制应注意哪些问题？
①注意琼脂和蔗糖的称量
②一定要添加2,4-D
③配制MS培养基时应该注意调节pH至5.7~5.8，因为过酸培养基不易凝固，过碱培养基会变硬，同时过酸或过碱还会影响到培养材料的生长。
④经高压高温灭菌后，由于某些成分的降解或氧化，酸度会增加（pH值一般可降低0.2），因此调整pH值时应加以考虑。
⑤培养基分瓶时要及时，否则会凝固。
⑥进行高压蒸汽灭菌时，当灭菌完成后，应切断热源，待锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，将余气放尽，再打开灭菌锅。
⑦经高压灭菌的培养基凝固后，宜放在培养室中预培养3～5天，若没有污染才可使用。暂时不用的培养基应放置在10℃以下保存，而含有生长调节物质的培养基则在4～5℃低温下保存更好。
2.培养基灭菌冷却后不凝固，请分析原因并提出解决办法。
①琼脂浓度太低。解决方法：继续加热，加入少量琼脂，溶解再次分装即可。
②pH值过酸。解决方法：测pH值，加入适量NaOH，使pH在5.7~5.8之间。