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斑马鱼早期胚胎背腹发育中ripply1的作用论文

胚轴（embryonicaxes）形成是多细胞生物躯体模式（bodyplan）建立的一个重要过程，主要包括前-后轴（anterior-posterioraxis）、背-腹轴（dorsal-ventralaxis）和左-右轴（left-rightaxis）.对两栖动物胚胎的研究发现背-腹轴早在受精后即可观察到，如爪蛙胚胎皮层转动形成的灰色新月区在后期发育成背部。德国发育生物学家HansSpemann和他的学生HildeMangold将原肠早期蝾螈胚胎的背部组织移植到另一种蝾螈胚胎的腹部，得到了形成双体轴的胚胎，次级体轴的脊索来自于供体胚胎，而神经管和体节多数来自于受体，这说明该背部组织能诱导周围受体胚胎的细胞形成神经管，首次提出了胚胎诱导的概念并称该背部组织为组织者（or-ganizer）.ripply家族蛋白在2005年被发现并揭示了其部分功能[1],研究发现ripply1和ripply2特异表达于体节，其中Ripply1蛋白与转录辅抑制因子Groucho结合，能够终止分节基因的表达，维持体节的前后极性。之后对ripply1的研究都集中在其在体节时期对体节发生的作用，而其在早期胚胎模式发生的作用却研究甚少。但最近在爪蛙中的研究发现ripply家族蛋白能通过其WRPW区域结合多梳蛋白（Polycombgroupproteins）起转录去抑制的作用，并且在背-腹轴形成过程中起重要作用[2].然而，rip-ply家族基因在胚胎发育早期的.表达图式和调节方式还不清楚。并且，ripply3是人的唐氏综合征关键区域基因6（Downsyndromecriticalregiongene6,dscr6）的同源基因[3].因此，研究ripply家族基因的功能和作用机制能为人类遗传疾病的致病机理提供信息。我们通过原位杂交技术发现ripply1在斑马鱼早期胚胎中特异表达在背部，因此推测其可能参与背腹发生。故而通过过表达ripply1,并调取1.2kb的启动子片段，初步研究其在胚胎早期背腹发生的作用。1材料和方法1.1材料AB品系的斑马鱼养殖在28.5℃的循环水系统中，如早期工作所描述[4].1.2方法1.2.1获取ripply1cDNA取斑马鱼胚盾（shield）时期的胚胎50枚，用Tr-izol方法提取胚胎总RNA,使用Transgene公司TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix试剂盒反转录，详细步骤参见使用说明书。1.2.2斑马鱼ripply1整胚原位杂交调取ripply1全长cDNA,引物序列如下ripply1-F:5'-CAGCGCCAAACAAAACG-3',ripply1-R:5'-TCAAATTCGCACAGACGG-3',使用Taq酶扩增后将其连入pGEM-T载体中。根据测序方向合成地高辛标记的反义RNA作为探针使用。其他探针如goosecoid（gsc）、chordin（chd）、floatinghead（flh）、even-skipped-like1（eve1）、T-box6（tbx6）、wnt8a详见作者以前的工作[5].合成的ripply1反义RNA用原位杂交液hyb+（50%甲酰胺，5×SSC,0.1%Tween-20,0.5mg/mL酵母RNA,0.05mg/mL肝素）稀释至1ng/μL.收集不同时期的斑马鱼胚胎，固定于4%多聚甲醛中过夜。过渡到含0.1%Tween-20的PBST中，并在PBST中将胚胎膜剥去，用PBST洗过后在原位杂交液hyb-（50%甲酰胺，5×SSC,0.1%Tween-20）中65℃孵育10min,之后在hyb+中65℃孵育4h.探针60℃孵育过夜。第2天吸出探针以重复使用。胚胎用洗液I（50%甲酰胺，2×SSC,0.1%Tween-20）洗30min（60℃）,重复1次；用洗液II（5%甲酰胺，0.2×SSC,0.1%Tween-20）洗15min（60℃）,重复1次；用洗液III（0.5%甲酰胺，0.02×SSC,0.1%Tween-20）洗30min（60℃）,重复1次。然后用MABT在室温下洗3次，用封闭液封闭4h.偶联碱性磷酸酶的地高辛抗体1∶2500稀释于封闭液中，4℃孵育过夜。第3天吸出抗体以重复使用，用MABT在室温下洗30min,重复1次；用PBST在室温下洗30min,重复1次；在平衡缓冲液（0.1mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HClpH9.5,0.05mol/LMgCl2,0.1%Tween-20）中平衡10min,加显色液（5mL平衡缓冲液中加100μL60mg/mL左旋咪唑，100μLNBT/BCIP）,室温避光，待信号足够强加多聚甲醛终止反应，在70%酒