福林-酚法测定蛋白质含量教案.doc

2010级生化实验

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福林-酚法测定蛋白质含量
目的要求
1．掌握福林-酚法测定蛋白质含量的原理及操作步骤。
2．进一步熟悉使用分光光度计的操作。
实验原理
在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜复合物。该复合物随后将磷钼酸-磷钨酸还原，发生显色反应，产生蓝色（钨兰+钼兰）。蓝色的强度在蛋白质浓度为25~250μg/mL之间时与蛋白质的含量成正比。
根据多组标准蛋白质溶液与福林-酚试剂反应后所测得的吸光度，绘制标准曲线。以此便可求出未知蛋白质溶液中的蛋白质含量。
仪器与试剂
仪器
分光光度计、试管与试管架、吸量管与洗耳球等
试剂
试剂甲：A液——10gNa2CO3，2gNaOH和0.5g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中。
B液——0.5gCuSO4·5H2O溶于100mL蒸馏水中。
试剂甲即为将两溶液以A：B=50:1的比例混合后所得的混合溶液。
试剂乙：在1.5升的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O），25g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700mL蒸馏水，再加入50mL85%磷酸，100mL浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管以小火回流约10小时。回流结束后加入150g硫酸锂，50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟一边驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色。注意此时溶液的黄色为亮金黄色，如仍有绿色显现，须再重复滴加液体溴的步骤。将所得溶液稀释至1000mL，过滤后将滤液保存在棕色试剂瓶中。
使用时用标准氢氧化钠溶液滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释（约加1倍水），使最终的酸浓度为1mol/L。
标准蛋白质溶液：取结晶BSA溶于蒸馏水，浓度为250μg/mL。
未知蛋白质溶液：浓度未知的牛血清酪蛋白溶液，使用时不需要稀释。
实验步骤
将试管标号并按下列顺序加入各试剂

试管123456789蛋白质含量/μg—2550100150200250——BSA标准溶液/mL—0.10.20.40.60.81.0——待测蛋白质溶液/mL———————0.51.0蒸馏水/mL1.00.90.80.60.40.2—0.5—试剂甲/mL均加入5mL摇匀，室温下放置10分钟试剂乙/mL均加入0.5mL，立即混匀，室温下放置30分钟后比色

选择波长为650nm进行比色，根据所得结果绘制标准曲线，由此可求未知蛋白质溶液蛋白质的含量。也可将数据输入Excel中利用图表得到散点图，并得出线性回归方程，由方程求出未知蛋白质溶液中蛋白质含量。
注意事项：
所用仪器的洁净程度要求较高，试管、移液管需到洁净的要求。
使用前注意检查移液管的尖端是否完好并且需要润洗。
取液时移液管的操作要规范，注意移液管上是否写有“吹”字样。
需要混合的操作要迅速。
分光计要等示数稳定以后再读数。
思考题：
含有什么氨基酸的蛋白质能与Folin-酚试剂呈蓝色反应？
作为标准蛋白的酪蛋白在应用时有何要求？为什么？
哪些因素可干扰Folin–酚法测定蛋白质？
结合实验经历，谈谈可以从哪些方面是实验结果更准确？