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γ-谷氨酰转肽酶酶学性质的研究

【摘要】目的了解地衣芽孢杆菌菌体细胞中γ-谷氨酰转肽酶的一些基础酶学性质。方法采用溶菌酶法破碎细胞壁，经硫酸铵沉淀后透析得到粗酶后，采用紫外分光光度法测定该酶的酶活力。结果该酶在25~35℃的温度范围有很好的耐受性，在碱性条件下保持一定的活性，最适反应温度为45℃，最适反应pH值为8.0，Ca2+、Mg2+等金属离子在适当浓度时对酶活性有促进作用。结论本实验为利用该酶转化生产茶氨酸提供了依据。【关键词】γ-谷氨酰转肽酶;酶学性质;茶氨酸Abstract:ObjectiveTounderstandsomebasicpropertiesofγ-glutamyltranspeptidasefromBacilluslicheniformis.MethodsLysozymewereusedtodisruptthecellwallandammoniumsulfatewereusedtoseparateprecipitationanddialysis,atlastthecrudeenzymewereobtained.UVspectrophotometrywereusedtomeasuredtheenzymeactivity.ResultsThisenzymewaswelltoleranttotemperatureintherangeof25~35℃,butinalkalineconditions,itmaintainedacertainactivity,theoptimumreactiontemperaturewas45℃andoptimumreactionpH8.0,generallytheappropriateconcentrationofmetalions,suchasCa2+,Mg2+,hadapositiveeffectontheactivity.ConclusionThisexperimentcouldbeusedinproductionoftheaninewithγ-glutamyltranspeptidase.Keywords:γ-glutamyltranspeptidase;enzymologicalproperty;L-theanineγ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GTP,EC2.3.2.2),又称γ-谷氨酰转移酶,在生物体内广泛存在,是谷胱甘肽(GSH)代谢的关键酶之一。该酶还参与了氨基酸的跨膜转运,可特异性催化γ-谷氨酰基的转移反应[1]。人们对γ-GTP的早期研究局限于该酶在GSH代谢中所起的作用[2]。随着研究的深入,人们对γ-GTP的催化功能和分子结构有了更多的了解,并发现其在临床上可作为肝胆疾病的生物标志,被广泛应用于肝病及其他脏器疾病的诊断和预后检测[3-4]。近年来,由于生物技术发展突飞猛进,生物催化与生物转化技术在工业生产中逐渐兴起,利用γ-GTP制备系列γ-谷氨酰基类化合物的研究已成为生物催化领域的热点。已有报道利用γ-谷氨酰基化(γ-glutamylization)反应合成了GG-DOPA等多种化合物[5-7]。目前，利用来源于枯草芽孢杆菌、基因工程改造的大肠埃希菌的γ-GTP生产茶氨酸[8](L-theanine,γ-L-glu-ethylamide)越来越受到人们的关注。该方法利用γ-GTP将L-谷氨酰胺上的γ-谷氨酰基转移到乙胺受体上,催化合成L-茶氨酸。但利用地衣芽孢杆菌发酵所产的γ-GTP转化合成茶氨酸尚未见报道。本文利用实验室筛选的γ-GTP高产菌株地衣芽孢杆菌发酵产酶，并研究该菌株所产的γ-GTP的基础酶学性质，为进一步利用地衣芽孢杆菌所产的γ-GTP生产茶氨酸提供依据。1材料与方法1.1主要材料与试剂菌种：地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)由本实验室筛选获得。试剂：Tris购自北京普博欣生物公司;L-γ-谷氨酰对硝基苯胺、双甘肽均购自广州威佳科技有限公司;硫酸铵为国产分析纯。1.2地衣芽孢杆菌的产酶发酵用接种环在活化好的菌种斜面上刮下一环菌种，将其转入到种子培养基，30℃、240r/min摇床振荡培养16h。以20%接种量转接于发酵培养基(30mL发酵液/300mL三角瓶)中，在30℃下240r/min摇床培养28h后收集菌体。1.3γ-GTP粗酶的制备γ-GTP发酵瓶培养液离心(4800r/min,10min)，弃上清液，用TE缓冲液(Tri-HCl缓冲液,pH8.0，10mol/L)重悬菌体,采用溶菌酶法以及硫酸铵盐析法制备粗酶液。1.4酶对温度的耐受性以TEpH8.0为缓冲液，不同温度下保存20min，测定酶活力[1]。1.5酶对pH的耐受性pH2.0采用Na2HP04柠檬酸缓冲