抗鳗利斯顿氏菌鸡卵黄抗体制备及其活性研究.doc

抗鳗利斯顿氏菌鸡卵黄抗体制备及其活性研究
周永强，李登峰收稿日期：2012-6-6
基金项目：浙江省公益性技术应用研究计划项目（2011C32004）、宁波市农业攻关项目（2011C10004）、宁波大学人才工程项目（XR0713017）、宁波市海洋蟹类产业科技创新团队项目（2011B81003）、宁波大学王宽诚幸福基金
作者简介：周永强（1987-），男，四川安岳人，硕士研究生，主要研究方向：水产动物病害防治.E-mail:[e-mail]
通讯作者：李登峰（1975-），女，湖南双峰人，副研究员、副教授，主要研究方向：水产动物病害防治.E-mail：[e-mail]
,刘联国，郭安南，陈炯，王重彬
（宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江宁波315211）

摘要：鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)是常见的水产动物致病菌。为获得高效抗鳗利斯顿氏菌卵黄抗体(eggyolkantibodies,IgY)，用纯培养的鳗利斯顿氏菌制备抗原，免疫蛋鸡，联用乙酸-乙酸钠稀释、(NH4)2SO4与Na2SO4盐析、透析法由蛋黄分离纯化卵黄抗体。对制备的IgY进行了体内、外抑菌活性与吞噬调理作用研究：分别将抗鳗利斯顿氏菌IgY、普通鸡蛋提取的IgY与鳗利斯顿氏菌（103CFU/ml）等体积混合后注射克氏原螯虾(Procambarusclarkia)，计算成活率；分别将抗鳗利斯顿氏菌IgY、普通鸡蛋提取的IgY与鳗利斯顿氏菌（106CFU/ml）及血细胞混合后，接种平板培养、计数。结果表明：提取的IgY浓度为8.93mg/ml，每个鸡蛋可获得IgY约120mg，抗体纯度较高，效价为1:20480；对鳗利斯顿氏菌的体外抑菌率为65%；能促进细胞对鳗利斯顿氏菌的吞噬，相对吞噬率为75%；对克氏原螯虾的保护率为33.3%。
关键词:鳗利斯顿氏菌;卵黄抗体；制备；抑菌活性；吞噬调理
中图分类号：S94文献标识码：A
鳗弧菌(L.anguillarum)引起的水产养殖动物疾病在世界范围内流行，可感染淡、海水鱼、虾、蟹、贝等，给水产养殖业造成巨大的经济损失[1-4]。随着水产养殖业的不断发展，水体生态环境恶化和养殖规模、密度不断提高，病害频发，越来越多的养殖户进入了“抗生素怪圈”—即大量使用抗生素。这不仅诱发耐药性和机体应激，亦破坏生态平衡，反过来又成为疾病发生的诱因，实为因治病而致病。此外，抗生素、化学药物的滥用还存在药物残留，危害产品的食用安全性，污染环境等问题。针对细菌性疾病研发抗生素替代品势在必行，成为当前研究的热点。
禽卵黄抗体(immunoglobulinofyolk,IgY)是抗生素的最佳替代品。自1893年Klemperer首次报道鸡蛋中存在抗体以来，卵黄抗体的研究不断深入，IgY的形成机制、生物学特性等方面已研究的比较清楚。IgY作为防治药物和诊断试剂的研究和应用愈来愈受到关注[5-13]。卵黄抗体可用于治疗由细菌、病毒、寄生虫等病原体引起的疾病，具有安全高效、无残留、不产生抗药性，服用简便等优点。针对卵黄抗体专一性强的特点，可以制备不同病原的卵黄抗体，对症下药，达到全面防治的效果。卵黄抗体在许多疾病尤其烈性、急性、危害性比较大的疫病（包括新城疫、传染性法氏囊病、小鹅瘟、鸭病毒性肝炎及脑脊髓炎、犬瘟热、猪瘟、泌乳期牛的乳房炎、牛腹泻、产肠毒素性大肠杆菌引起的仔猪腹泻等）的防治上已有成功尝试[14-19]。已有众多人、畜用卵黄抗体制剂获得批准进入市场。水产养殖动物病原卵黄抗体研究相对落后，报道较少。本研究以灭活的鳗利斯顿氏菌纯培养物作为抗原，制备抗鳗利斯顿氏菌IgY，探讨其抑菌、吞噬调理效果，以期为鳗利斯顿氏菌病害的防治奠定基础。
材料与方法
材料
鳗利斯顿氏菌菌种：本实验室由香鱼(Plecoglossusaltivelis)中分离、纯化、鉴定后超低温冰箱保存；海兰白蛋鸡(HylineWhiteLayinghens)：购于宁波慈溪益大养殖场；克氏原螯虾(P.clarkia)：购于宁波大学菜市场，体长8-10cm，附肢完整，实验室暂养1-2周仍然健壮，无死亡个体后，投入试验；血细胞：以肝素为抗凝剂，用1ml一次性无菌注射器由静脉抽取健康鸡血，离心并用PBS清洗后，用生理盐水悬浮。若干（1-2ml），加入，实验前立刻配制使用以防止失活；辣根过氧化酶标记羊抗鸡抗体：购于北京博奥森生物公司；LB培养基自配：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl10g，琼脂17g，加双重水至1000ml，调pH至7.2；乙酸-乙酸钠（pH5.0）：加2.86ml乙酸，乙酸钠2.324g，以1000ml双重水溶解，用20%NaOH调pH至5.0；
ELISA试剂:包被缓冲液：0.05MpH9