丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1.ppt

丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇试验的研究低成本生产丁醇的必要性原始农作物本实验所用菌种试验内容一、玉米秸秆水解实验设计1.试验材料：玉米秸秆、纤维素酶、及其他试剂和器材
2.试验方法：
（1）玉米秸秆的预处理。碱浸泡法:3%的NaOH,固液比
为1∶10,室温浸泡24h,过滤,滤渣洗净后于60℃烘干水分至恒重。氨水浸泡:10%的氨水,固液比为1∶10,室温浸泡24h,过滤,滤渣洗净后于60℃烘干水分至恒重。以不作处理玉米秸秆作为对照。
（2）酶水解反应条件。称取1g秸秆于250ml锥形瓶,加入纤维素酶溶液(0.05mol/L,pH值4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液),将三角瓶置于恒温水浴振荡摇床上进行酶解反应,温度50℃,转速100r/min,反应时间36h。反应结束,离心取上清液进行还原糖的分析。

(1)秸秆成分分析。测定预处理前后1g秸秆粉中的
纤维素、半纤维素及木质素含量。
(2)还原糖的测定。DNS法。
(3)酶水解率测定。
酶水解率(%)=﹛a×0.9／m×(1-w)﹜×100
式中,a为还原糖质量,m为秸秆质量,w为含水率。
设计因素：
1.粉碎程度对酶水解的影响：
该试验采用15目、60目和200目的秸秆粉碎程度考察粒径大小对酶水解的影响。
2.温度对酶水解的影响：
设计30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃。七个梯度对酶水解的影响。

3.纤维素酶的用量对酶水解的影响：
分别设置200、400、600、800、1000、1200U／g六个梯度。
4.pH值对酶水解的影响:
分别设置pH=3、4、5、6、7、8进行试验。
5.底物浓度对酶水解的影响：
设置固液比为1：10、1：20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70几种底物浓度做试验。
二、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇培养基及发酵条件优化
糖浓度:40、60、80、100、120g/L
pH值:4、5、6、7、8
碳氮比:37、42、47、52、57
邻氨基苯甲酸浓度:0.0005、0.001、0.0015、0.002、0.0025和0.003g/L
发酵温度:32、34、36、38、40℃
转速:150、160、170、180、200r/min
D正交设计实验发酵培养基(g/L):
培养基选取葡萄糖为碳源，醋酸按为无机氮源，并添加适量邻氨基苯甲酸。由于培养基的碳氮比C/N、初始pH、发酵温度以及生长因子对微生物的丙酮、丁醇合成影响很大，故对发酵培养基的C/N，初始pH，邻氨基苯甲酸浓度，发酵温度进行均匀设计实验，以达到优化发酵培养基和发酵条件的目的。
按照实验设计按下表配制;

a.菌种活化培养:将lmL菌种接种于20mL玉米醪试管培养基中，沸水浴下热处理1一2min，37℃下厌氧活化培养。
b.摇瓶培养(单因素实验):将活化好菌种以体积比10%的接种量接种于100mL单因素实验发酵培养基中，充氮气10min，于37℃，150r/min摇床培养。
c.摇瓶培养(正交设计实验):将活化好菌种以体积比10%的接种量接种于100mL正交设计实验发酵培养基中，充氮气10min，于37℃，150r/min摇床培养。
d.摇瓶培养(优化验证实验):将活化好菌种以体积比10%的接种量接种于100mL优化培养基中，初始pH值5.5，充氮气10min，于37.5℃，150r/min摇床培养。
e.发酵罐培养:将lL优化培养基加入1.5L发酵罐中，121℃下饱和蒸汽灭菌20min，冷却后，将活化好菌种以体积比10%的接种量加入发酵罐内，通氮气30min，设定温度为37.5℃，转速150r/min，初始pH值5.5的条件下发酵

(1)葡萄糖、果糖浓度的测定
采用DNS法测定
(2)丙酮、丁醇、乙醇浓度的测定
用气相色谱测定，
(3)含氮量的测定
采用凯氏定氮法测定。
(4)菌体生物量的测定
采用酶标仪测定620nm下的菌体浓度
（2）对照组培养基:

碳源分别为葡萄糖和果糖，浓度和玉米秸秆水解液保持一致，添加醋酸按(调好C/N比)，培养基中其他组成同玉米秸秆培养基，初始pH5.5。

以上培养基均在121℃饱和蒸汽下灭菌15min。
三、以玉米秸秆水解液为底物发酵产丁醇的研究（1）不同底物发酵过程中主要产物分析
（2）不同底物发酵过程中副产物分析
（3）不同底物浓度发酵的比较（丁醇产量和残余糖浓度）

测定方法：
(1)葡萄糖、果糖浓度的测定采：用DNs法测定
(2)丙酮、丁醇、乙醇浓度的测定：用气相色谱测定，
(3)丁酸、乙酸的测定：采用HPLC法分析
谢谢