半薄超薄切片技术.ppt

半薄/超薄切片技术背景：半薄切片一、超薄切片技术介绍固定地好
渗透包埋地好
切地好
载网膜做地好
染地好超薄切片主要步骤1取材1.2取材方法
材料放在洁净的韧性较大的纸上
滴上预冷的固定液
用刀片将组织切下并修小
用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。
植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。2固定(抽气)2.2常用固定剂(2)戊二醛(C5H8O2)--glutaraldehyde
※有效保存组织细微结构,对蛋白质的固定效果好；
※渗透力强,渗透速度快,较好的固定糖原、核蛋白、微管、内质网和细胞基质、有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡等；
※保存某些酶的活力,较好保存抗原,适于细胞化学研究；
※对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，均匀固定深度:0.5~1mm,0－4℃可长时间固定(几周甚至1～2个月)不会使组织变脆，可用于远离实验室的取材;
▼缺点:不能保存脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显示较差，没有电子染色作用。(3)甲醛-Formaldehyde
※渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织（种子）固定作用好；
※细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活性的保存优于戊二醛；
▼缺点：不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失；

＊常用多聚甲醛－戊二醛的混合固定液。(4)高锰酸钾
※强氧化剂，较好固定脂蛋白;
※对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜结构的研究均可作为固定剂；
※只用于某些常用固定剂难以固定的植物和酵母样品，且一般不需要用锇酸后固定.3漂洗、脱水常用缓冲液3.2脱水

目的
将组织内的游离水彻底清除,保证包埋介质完全渗入组织内部。

方法
用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水,常用的脱水剂是乙醇和丙酮。注意事项
脱水梯度逐级进行,急剧脱水会引起细胞收缩。（30%→50%→70%→80%→95%→100%→100%）;
更换溶液动作要快。长时间暴露空气中会在组织内外产生微小气泡，影响渗透；
脱水过程中应在70%脱水剂中4℃停留或过夜,过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使样品发脆，造成切片困难;
置换用脱水剂：环氧丙烷（Epon812）、二甲苯（石蜡）。4渗透和包埋、聚合4.2包埋、聚合常用的包埋剂Epon812◆水溶性树脂－丙烯酸类树脂

LRWhite、Lowicryls、GMA、PEG等，适于进行组织化学和细胞化学研究的样品制备。
适于低温包埋，通常用于免疫电镜样品的制备。包埋操作中的注意事项
§所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中；
§所用器皿应烘干；
§配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；
§包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；
§盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净.
§皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；5超薄切片5.2超薄切片

超薄切片机：LEICAULTRACUTR

超薄切片厚度:
<100nm,一般50-70nm5.3载网和支持膜直径：2-3mm，厚度：0.03-0.02mm5.3载网和支持膜6超薄切片的染色常用的染色剂:醋酸铀和柠檬酸铅。

染色方法：

(1)组织块染色
在脱水至70%乙醇时，将组织块放在用70%乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间2小时以上，或在冰箱中过夜。(2)超薄切片后染色1）前固定（固定液体积是固定材料的十倍以上，材料不堆积）
3%戊二醛in0.1MPBS,ph7.2，室温5-6h，后4°C保存
2）漂洗：0.1MPBSPh7.2充分漂洗3-4次，20-30Min/次
3）后固定
1%锇酸固定in0.1MPBS，4°Covernight
4）漂洗：0.1MPBSPh7.2充分漂洗3-4次，20-30Min/次
5）系列脱水：30%-50%-70%（4°C,overnight,可以停下）-80%-95%-100%-100%）
用丙酮置换乙醇：
乙醇:丙酮=1:1，纯丙酮2次，每级20-30分钟
6）渗透
丙酮:树脂=2:1，1:1（可以停下了，overnight），1:22-3h/级
纯树脂12h，
换纯树脂12h（从进入树脂开始更要严格防潮！）
7）包埋聚合60°C24hr

注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固定液可以是1.25%戊二醛+1.25%多聚甲醛in0.1MPBSPh7.2超薄切片图片二、半薄切片技术介绍半薄切片主要步骤FAA固定液
（福尔马林5-冰醋酸5-70%酒精90）半薄/石蜡切片
※一般固定根、茎、叶、花药、子房组织切片。
※幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，防止材料收缩；
※加入5%甘油可防固定液蒸发和材料变硬。卡诺固定液切片厚度：0.5~5um

切片捞到载玻片上▲半薄切片染色染料介绍半薄切片图片三、刀具介绍超薄切片机