未培养微生物综述.doc

未培养微生物研究进展

摘要未培养微生物主要是一种现在不能人工培样得到的微生物，由于现在的检测手段相对来说比培养手段要先进，所以研究未培养微生物体现除了巨大的研究前景，本文主要从未培养微生物的研究手段，主要的研究方向进行简述。
关键词未培养微生物培养分子生物学技术

1、未培养微生物的定义
未培养微生物(unculturedmicroorganisms)最早先是由Colwell在1982年提出的，后来Stackebrandt等将那些利用分子生物学技术能够检测到,但还不能获得纯培养的微生物定义为（至今未培养微生物asyetunculturedmicroorganisms)其定义包括那些可获得纯培养,但在环境因子的胁迫下不能生长、处于休眠状态下的微生物。迄今可培养的微生物仅约占自然界存在微生物的1.0%或更少，但是蕴藏于这类微生物中蕴藏大量的可供人类开发利用的生物资源。并且这一类微生物在自然环境中所占的比例很高。大部分未培养微生物存在于有机物贫乏的极端环境中，如远洋、深海、贫瘠土壤等。
未培养微生物广泛存在于各个自然环境中，在各种极端环境中尤为丰富，在生态系统、物种、一串等三个方面都表现出了极其丰富的多样性。也表明未培养微生物有着巨大的开发研究前景。
对于未培养微生物主要是基于两个方面想进行的，纯培养分离技术与基于分子生物学技术的一些手段。传统的主要是运用培养技术，由于其分离技术的限制局限性比较大，所以还多的人注重于分子生物学手段。

2、通过纯培养分离技术研究未培养微生物
纯培养分离技术为微生物研究的重要手段之一。各种新型的分离培养方法的出现，使得越来越多的不可培养微生物被分离出来。对于未培养微生物进行的可培养研究主要是基于原位仿生境培养、限制性培养、单细胞微操作等。
原位仿生境培养就是在人工培养条件下，讲卫生物质与特殊的载体上，利用其代谢产物及信号分子可自由扩散而相互利用，从而可以得到类似于原先的自然生态环境状态，使微生物的生存环境与在自然状态下类似，从而将尽可能多的不可培养微生物转变成可培养的微生物。它的优点是既能纯培养又能保证微生物的原生态特性，弥补纯培养的部分弱点。
另一种是限制性培养的方法。由于在传统的培养基中，其营养丰富、生长底物适合大多数微生物，微生物的培养条件较温和等，所以培养出的微生物主要是生长较快的普通优势菌种，这种培养基并不适用于某些有特殊嗜好的微生物，所以部分微生物并不能被培养得到，所以按照我们分离的目的微生物的特性进行培养基的设计，从而达到特殊微生物可以生存、生长的条件，现在常见的有：厌氧、高温、高盐、寡营养、特殊的培养底物等。
单细胞微操作策略是借助特殊的仪器设备，对于单个的微生物细胞从从采样中挑选出来，常见辅助设备有:显微操作仪、光学镊子、流式细胞仪等。得到单个的微生物细胞之后对于分离得到的单细胞进行扩大培养，可以得到纯培养物，或对于细胞进行单细胞PCR扩增得到其基因。这个手段可以尽量的避免微生物数量少、生长受其他微生物抑制或生长缓慢等因素导致的“不可培养”。

3、通过分子生物学手段对于未培养微生物的研究
分子生物学技术手段在未培养微生物研究中的应用，在自然生态环境由于其复杂性、动态变化性、微生物的种类多种多样，所以不可能将所有的微生物都转变成可培养的微生物。所以依赖于分子生物学技术对未培养微生物进行研究有其重要的意义。其研究的主要基于以下几个方面：
未培养方法的rRNA序列分析，这种方法是先直接从环境样品中提取总DNA，再以rRNA的保守区作为引物进行PCR扩增，测定rRNA核苷酸序列，通过序列比对，推断未培养微生物的种类和组成。自从16SrRNA基因作为分子标记来研究微生物的组成和系统发育以来，越来越多的rRNA分子标记被应用未培养微生物的研究中。常选用的序列分析标记有:16SrRNA基因、ITS区基因、18SrRNA基因、26SrRNA基因、28SrRNA基因、线粒体COI基因等。最早的应用是在早在上世纪90年代初，迄今为止，已经得到巨大的成绩，在原核微生物分类类群中还有约1/2的类群没有得到纯培养的代表种，仅以16SrRNA序列方式被记录下来。并且近年来基于未培养方法的rRNA序列分析技术也被广泛应用于海洋科学研究中。
基于宏基因组文库和高通量测序技术对于未培养微生物的研究也有巨大的进展，目前对于未培养微生物的新基因和新活性物质的分析筛选主要依赖于宏基因组的文库构建技术和高通量DNA测序技术。宏基因组文库技术是直接提取样品中的总DNA，克隆到可培养的宿主细胞中以构建宏基因组文库，从获得的克隆中进行功能筛选和序列分析，文库包含了可培养的和不能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养等问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间。是研究未培养微生物，寻找新功能基因和开发获得新活性物质的重要新途径。