原代成骨细胞、成纤维细胞培养SOP.doc

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OIStandardOperatingProcedure
版本号：V1创建日期：9/3/2011创建者:杨小萌校对日期：校对者:PageofNUMPAGES2

原代成骨细胞、成纤维细胞培养
和仪器，技术相关的危害物质
无
准备工作
仪器和耗材：
TDGC2J超净工作台（苏州净化设备厂）
AUTOCLAVEMLS-3780高压灭菌锅（SANYO）
DGG-9140B型电热烘干箱（上海森信实验仪器有限公司）
DK-8D型水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）
SZ-93纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）
COICXDS-1B倒置显微镜
MCO-15ACCO2INCUBATOR(细胞培养箱，日本Sanyo)
移液器(Gilson公司)
废液缸
10μl,200μl,1000μl无菌枪头
一次性无菌吸头
4℃冰箱（海尔）
细胞培养瓶（25cm2）
手术器材（高压灭菌）
培养皿
试剂：
DMEM(无血清)
无菌水
含胎牛血清20%的DMEM
1xPBS
胶原酶I
操作者防护措施
实验服
手套
注意面部防护
工作区域
超净工作台
流程
准备工作：
操作步骤：
将患者组织用提前用火烧过镊子夹到培养皿中。
用5mlPBS冲洗2次。
另取两个培养皿分别标记患者姓名，编号，SK或BO，并分别加入5mlDMEM(1XPBS)。
将各组织（肌肉，骨）按标好的分别放到各培养皿中。
用火烧过的剪刀跟镊子分别剪碎皮肤跟骨，各加入80微升胶原酶I。混均，于37℃，5%CO2孵箱中培养，3小时。
取两个15ml离心管，标记SK,BO,培养瓶标记OI-姓名-SK/BO-1.
吸取培养皿中培养液于孔筛中过滤到15ml离心管中，1500r/10min离心。
吸上清培养液于培养皿中，37℃继续培养（每隔3小时收集一次细胞）。
加1ml带血清的DMEM于离心管中，重悬细胞，转移到小培养瓶中。
再于培养瓶中加4mlDMEM（带血清），37℃，5%CO2孵箱中培养。
每隔3小时重复一次，共3次。
培养瓶中的细胞每3天换一次液（换液前用PBS冲洗两遍）。
清洁流程
75%乙醇擦拭超净工作台
紫外照射30分钟
废物、废液处理
84消毒液清洗废液缸，废弃物集中处理