实验二、琼脂糖凝胶电泳及DNA纯化-2.ppt

实验二琼脂糖凝胶电泳及DNA的纯化一、实验目的
1、掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法
2、掌握回收试剂盒纯化DNA的方法
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。三、实验材料、器具及药品
电泳：
实验一的PCR产物样品。
电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外凝胶成像系统等。
琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载样缓冲液
纯化：
回收试剂盒四、实验步骤
⑴1g琼脂糖加入100ml1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。
⑵用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。
⑶将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。
⑷用移液器吸取PCR产物样品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
⑸打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。⑺将染色后的凝胶置于紫外凝胶成像系统上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。常用的电泳缓冲液Ⅰ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液
Ⅱ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液7、用干净的刀片切出所需DNA条带，注意要在长波长（≥300nm）UV灯下操作，并快速操作，以免损伤DNA。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶。
8、使用TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶。称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1μL进行计算(100mg=100μL)。
按照凝胶浓度，按下表提供的参数加入相应3倍体积的NaI。均匀混合后55℃加热融化胶块。间断振荡混合，使胶块充分融化(约10分钟)。
加入20微升的硅胶树脂，充分混匀后室温放置20分钟。
注：硅胶树脂使用前，一定要将硅胶树脂液充分搅匀。
6.离心（10，000rpm、1分钟）后除去上清液。
注：此上清液在整个回收过程结束后，确认回收率较高时方可废弃。如果回收率较低时，可在此上清液中再次加入硅胶树脂液，重新吸附。
7.在Microtube中加入800μL清洗液，振荡搅匀后室温静置10分钟，然后离心（10，000rpm、1分钟），除去上清液。
注：请确认清洗液中已经加入指定体积的100%乙醇。
重复操作7（不需要静置10分钟）
注：为提高DNA片段的回收效率，此时应尽量除净上清液（完全风干至不含残留的乙醇气味）
9.加入和硅胶树脂等量（体积比）30μL的灭菌蒸馏水后搅匀，55℃水浴中放置10分钟。
离心（10，000rpm、1分钟）后吸取上清液，尽量注意不要吸取硅胶树脂。此回收上清液即可为DNA回收溶液。

几点注意事项加以说明：作业