农杆菌介导的水稻转化.doc

农杆菌介导的水稻转化
实验目的
学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。
实验原理
随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。
水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。DNA直接导入法主要包括PEG（polyethyleneglycol）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。所以已成为转化单子叶植物的首选方法。
一、目标基因对农杆菌的转化
1.1农杆菌感受态细胞的制备
取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线，28℃黑暗培养。
挑取单菌落接种于5mlYM液体培养基中，220rpm28℃振荡培养12-16小时。
取2ml菌液转接于100mlYM液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.5。
转入无菌离心管，5000rpm离心5分钟,去上清液。
加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20分钟后，4℃，5000rpm离心5分钟，去上清。
加入4ml预冷的含10%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。
1.2.双元载体转化农杆菌EHA105
取1μg左右的质粒DNA加入到200mlEHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30分钟，-70℃放置3分钟，42℃水浴1-2分钟，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培2-3小时后涂在含50μg/mlKanamycin的YM平板上，28℃培养。
1.3农杆菌转化子的PCR鉴定
将农杆菌转化子，用PCR方法鉴定是否正确转进EHA105中。挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/mlKanamycin的YM液体培养基中，28℃，220rpm摇培16小时，直接用菌液做PCR。PCR所用的引物为pCAMBIA1301载体上特异性的引物FP35S：5’-TACGCACAATCCCACTATCCTT-3’，RPGUS：5’-CTGATGCTCCATCACTTCCTGA-3’。
PCR反应参数设置：
94℃预变性3分钟后开始以下循环反应：
94℃变性30秒，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，
35个循环后72℃继续延伸10分钟，反应结束后，取20μl反应液在1.0%琼脂糖凝胶中电泳扩增产物。
PCR反应体系
母液浓度体积终浓度农杆菌转化子菌液体2μlP12μM2μl200nMP22μM2μl200nM10×PCRBuffer2μlMg2+25mM1.2μl1.5mMdNTP2.5mM1.2μl150μMTaq酶5U/μl0.2μl1UH2O9.4μl终体积20μl
2.根癌农杆菌介导的水稻转化
2.1.水稻转化受体的准备
2.1.1.水稻幼胚愈伤组织的诱导培养
取开花后12-15天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡90分钟进行表面灭菌，灭菌时要经常搅拌。用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基（NB培养基）上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基（NB培养基）上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。
2.1.2.水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养
去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用0.1%升汞浸泡30分钟，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃