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生物化学与生物物理进展,年第!期

几种微量测定蛋白质新方法的比较

郭燕捷姚志建

,
∀军事医学科学院基础医学研究所北京#

蛋白质的微量定量测定法至今最广为使用毫升ϑ多乙醇,加水至6毫升,室温下可保存
的是∃%&∋(改进的)%∗+,酚法∃‘,。但是∃%&∋(数周。

Α
法的操作较为麻烦,灵敏度有时也达不到要求,测定操作≅∗毫升样品液加毫升∀>#

,,
因此在最近的十年许多研究者仍在继续寻找液,均匀混合于分钟到小时之间在ϑ,Λ

。
更为合用的新方法,−./∗%处对试剂空白比色

,、,
我们在参考国外文献的基础上有选择地三.6Μ4%/,Λ紫外吸收法,,
建立了几种微量测定蛋白的新方法,并对它们配制一定浓度的蛋白质溶液,测定其在

。。
的优缺点和适用范围加以比较现将主要结果.96,Λ处的光吸收,记下读数然后将该溶液适

。
介绍如下当稀释∀约6一Κ6倍#,再于.6,Λ处测其光
吸收。并分别与各自的标准曲线相比较,即可

材料和方法。,,
知样品的浓度同时根据下列公式可计算出

、
一∃%&∋(法该样品中所含蛋白质的绝对量≅

。Α
配制含有下列成分的混合淤液∀0#Ν一04%/Μ.86Ο.6∀0,Μ0,#Π
·、·,,
12%&%3454%66克127%3454%.克加式中的尸为样品蛋白的绝对量∀毫克Μ毫升#

,、。
蒸馏水86毫升9:磷酸6毫升浓盐酸604,与禹96分别为样品液在.∀#,Λ与.9=,∗
,,,
毫升迥流6个小时然后加人∃;<=,6克处的光吸收∀计算时要注意校正测定时所使用

,,,。
蒸馏水6毫升几滴漠水持续沸腾分钟的不同稀释倍数#

、
冷却,稀释至666毫升,置棕色瓶中暗处存放。四荧光法−Π

Α
、、Α、
∀>#12%5;克12?%≅克酒石酸钾钠66试剂≅∀0#667氢氧化钠用磷酸调

、Α·ΑΑΘ
克各自溶解,混合,再取。Β.克ΧΔ/Ε<5必Ν5至9一996∀>#Κ6毫克荧光胺∀)∗Δ%∋?/?

,2,,,
溶解后加人到混合液中稀释至最终体积为6Λ+∗?/?∋(。产#溶于6毫开丙酮内在室

。。
毫升温下可存放二周∀Χ#1盐酸∀以恒沸点盐酸

,
测定操作≅取被测液毫升加∀>#液酉己制#。
毫升,置室温6分钟后加入倍稀释的∀0#测定操作之一≅.微升样品液加人.6微

,,。
液斗毫升,℃水浴中保温分钟,冷却在升∀0#液和66微升∀>#液用力振荡于激
6二,下对试剂空白测光密度。发波长Κϑ9,Λ照射下,测!9∀∗,Λ处的荧光强

、
二染料结合法∀>∋2ΦΓ%∋Φ法#〔叼度。

2≅,
试剂≅∀0#贮存液≅∗克/?∋Η蓝Ι∀西德测定操作之二样品置清洁的安瓶中加

,,
/?∋、2公司#加.66毫升9外磷酸及66毫升.6微升∀Χ#液,充氮并在真空下封管,6℃

。。,
ϑ汤乙醇溶液,室温下可长期保存∀>#应用水解.6小时测定前先于低温下令盐酸挥发
液≅Κ6毫升贮存液,加人96毫升9务磷酸及刊至干,然后溶于适当量∀0#液中,按测定操作
,。
之一的比例加人∀>#液同样条件下测荧光浓度,分别用上述几种方法进行测定,检查各种
以上方法中所用的试剂,除特殊标定的之方法的灵敏度及基本呈线性反应的区域,其结

。
外,都为北京化工厂生产的分析纯试剂测定果可总结为图。

、
样品为牛血清白蛋白∀美国<+ΡΛ2公司#。所二方法的稳定性
用的可见光分光光度计为上海第三分析仪器厂这里所谓方法的稳定性是指该方法的操

,
生产的8.型紫外分光光度计为日本岛津公作,不同测定批次中测定结果的一致程度。所有
司的ΔΗ一.6一6.型,荧光测定是用日本岛津的这些方法中,紫外吸收法最稳定,因为它所涉及

。
Σ)一!6型荧光分光光度计。的仅仅是溶液本身的性质染料结合法与∃%&∋(
法的情况相似,都在试剂加完后的分钟到。
结果与讨论。
分钟之间基本稳定荧光法则需准确地掌握激

、
一测定方法的灵敏范围发光照射的时间长度,因为在激发光的连续照
我们取牛血清白蛋白为样品,稀释成各种射下,荧光会逐渐减弱,所以我们采用的方法是,
当样品液与荧光液混匀后,置人比色杯,然后打
开激发光光门,此时荧光读数逐渐上升,取其上
ΤΥ.96吸收升至最高点后基本稳定的那一瞬间的读数。但
上。&∗(法,如果样品与荧光试混,未加激
卜ΘΘςΘ尸罗ΘΘΘ一,曰是液剂合后发

Ω
ΤΥ.6吸收光,则其在到6分钟内呈基本稳定。
染料结合法上述几种方法重复测定所取得的读数,重

,。
嘴光法演性基本良好它们的变异系数列于表

十、
Ξ水解贾光法三操作的简便程度及其它特点

,,

,紫外法不品如对
!通,6一吸收操作简便破坏样果
#∀‘一
甘