质粒DNA的提取、酶切与鉴定.doc

实验二十一质粒DNA的提取、酶切与鉴定
一、质粒DNA的提取
[原理]分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
本实验采用碱变性法抽提质粒DNA，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
[试剂]
1.溶液I：
50mmol/L葡萄糖、10mmol/LEDTA、25mmol/LTris-HClpH8.0;用前加溶菌酶4mg/ml。
2.溶液II：
200mmol/LNaOH、1%SDS。
3.溶液III：
pH4.8醋酸钾缓冲液（60ml5mol/L醋酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml蒸馏水）
4.TE缓冲液pH8.0
5.含RNaseA的TE缓冲液：TE缓冲液含20μg/mlRNaseA。
6.苯酚：氯仿（1：1，v/v）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使体积分数为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为24：1（v/v）。
7.1×LB溶液
8.100μg/ml氨苄青霉素
[器材]
1.TGL-16型台式高速离心机
2.1.5ml塑料离心管
3.离心管架
4.微量移液器
5.常用玻璃器皿
[操作步骤]
1.培养细菌将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的1×LB中，37℃培养过夜。
2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10000r/min离心lmin，去掉上清液。加入150μl溶液I，充分混匀，在室温下放置10min。
3.加入200μl新配制的溶液II，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置2min。
4.加入150μl冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置10min。
5.用台式高速离心机，10000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中。
6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v），振荡混匀，转速10000r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。
7.向上清液加5mol/LNaCl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
8.加0.5ml70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。
9.加入50μl含RNaseA20μg/ml的TE缓冲液溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解待用或置-20℃备用。

二、质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定
[原理]限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。
Ⅱ型限制性内切酶，具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子质量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出大分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
[试剂]
1.EcoRI酶解反应液（10×）:1mol/LpH7.5Tris-HCl,0.5mol/LNaCl,0.1mol/LMgCl2。
2.HindIII酶解反应液（10×）：1mol/LpH7.4Tris-HCl,1mol/LNaCl,0.07mol/LMgCl2。
3.50×TAE电泳缓冲液：称取242克Tris，加入57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/LEDTA，调节pH至8.0，加蒸馏水至1000ml。
4.凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、40%蔗糖水溶液（w/v）。
5.1%琼脂糖凝胶：1×TAE100ml含1g琼脂糖。
6.pUC19质粒
[器材]
电泳仪
电泳槽
样品槽模板（梳子）
锥型瓶（100ml或50ml）
紫外灯
一次性塑料手套
凝胶成像系统
[操作步骤]
1.质粒DNA的酶解
将上一实验纯化