三种复方对慢性应激肝郁模型大鼠海马BDNF、CREB基因表.pdf

http://www.paper.edu.cn

三种复方对慢性应激肝郁模型大鼠海马BDNF、
1
CREB基因表达的影响
于琦，金光亮*
北京中医药大学中医基础理论系北京(100029）
E-mail：[e-mail]
摘要：目的：探讨慢性应激肝郁模型大鼠海马BDNF、CREB基因表达及疏肝、疏肝健脾
与健脾三种方剂的效应。方法：SD雄性大鼠40只，用随机区组设计的方法分为对照组、模
型组、四逆散组、逍遥散组和四君子汤组，处理21天后，测定1%蔗糖水摄取率和强迫游泳
不动时间，用RT-PCR的方法检测海马BDNF和CREB的mRNA表达。结果：与对照组比较，
模型组大鼠1%蔗糖水摄取率明显降低，强迫游泳不动时间明显延长（P<0.01），海马BDNF、
CREB的mRNA表达明显降低（P<0.05）；与模型组比较，四逆散组、逍遥散组的1%蔗糖水
摄取率明显升高，强迫游泳不动时间明显缩短（P<0.01），BDNF、CREB的mRNA表达均
明显升高（P<0.05）；四君子汤组1%蔗糖水摄取率、强迫游泳不动时间及BDNF表达量与模
型组相比没有差异（P>0.05），仅CREB表达升高（P<0.01）。结论：慢性应激肝郁模型大
鼠海马BDNF、CREB的mRNA表达降低，具有疏肝作用的方剂四逆散和逍遥散可以对抗这
种降低，而健脾方剂四君子汤无明显效应。
关键词：慢性应激；肝郁；四逆散；逍遥散；四君子汤；脑源性神经营养因子；cAMP反应
元件结合蛋白

肝郁证是临床常见的基础证候，情志刺激是其主要病因，多见于与慢性应激密切相关
的疾病。为了深入研究肝郁证的发生发展机理，我们建立了慢性应激肝郁证大鼠模型[1]，从
临床发病学特点、核心症状和逍遥散的治疗效应等方面，分析了模型该的合理性[2]，还将模
型大鼠强迫游泳中不动时间的观察，与1%蔗糖水摄取量测定相结合，共同模拟肝郁证的核
心症状，通过比较疏肝方四逆散、疏肝健脾方逍遥散和健脾方四君子汤对上述行为学的影响
[3]，表明该模型可从多方面模拟中医肝郁证。在本研究中，我们基于国际上有关慢性应激影
响海马神经元再生机理的新认识，探讨了慢性应激肝郁模型大鼠海马内与神经元再生相关蛋
白脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophicfactor,BDNF）、环磷酸腺苷反应元件结
合蛋白(cAMPresponseelementbindingprotein,CREB)的基因表达变化，并观察了四逆散、
逍遥散、四君子汤三个不同治法代表方剂的干预作用。
1材料与方法
1.1药物
根据《方剂学》[4]确定方剂的组成，其中逍遥散（《太平惠民和剂局方》）：柴胡9g，当
归9g，芍药9g，茯苓9g，白术9g，薄荷3g，炙甘草4.5g，生姜6g；四逆散（《伤寒论》）：
柴胡6g，枳实6g，生白芍6g，炙甘草6g；四君子汤（《太平惠民和剂局方》）：人参9g，白
术9g，茯苓9g，炙甘草6g。上述各方用饮用水将中药免煎颗粒（江阴天江药业有限公司），
以成人（按60kg计）1日用量的14倍配制成悬浊液，其中逍遥散浓度为1.365g/ml，四逆
散浓度为0.56g/ml，四君子汤浓度为0.77g/ml。

1.2试剂与仪器

1本课题得到国家自然科学基金项目（No.30171129）、北京中医药大学“211工程”建设子项目（2001-02）
的资助。
*通讯作者：金光亮。

-1-
http://www.paper.edu.cn

BDNF引物序列为：BDNF－1:GGGGTTAGGAGAAGTCAAGC;BDNF－2:CAGTG
GGACTCCAGAAGACA，扩增片断288bp；β－actin引物序列为：上游引物：
ATCATGTTTGAGACCTTCAACA;下游引物：CATCTCTTGCTCGAAGTCCA，扩增片断
318bp；均用Primer5软件自行设计，由北京奥科生物公司合成。CREB引物序列为：CREB-1:
TCAGCCGGGTACTACCATTC;CREB-2:TCTCTTGCTGCTTCCCTGTT，扩增片断252bp[5]；
北京赛百盛生物公司合成。RNA酶抑制剂，Promega公司；M-MLV逆转录酶，Promega公
司；M-MLVRT-5×Reactionbuffer，Promega公司；dNTPs（10Mm，pH=7.5），Genview；
2×taqPCRmix，欣源佳和公司；无水乙醇，北京化学试剂公司；异丙醇，北京化学试剂公司；
三氯甲烷，北京化学试剂公司；TRIzolReagent，Gibcol公司；琼脂糖，Biowest公司。
HY-2调速多用振荡器，购自江苏金坛金城国胜实验仪器厂；电热鼓风干燥箱，购自天
津市泰斯特仪器有限公司；台式高速冷冻离