临床分离产头孢菌素酶阴沟肠杆菌的耐药性研究.doc

临床分离产头孢菌素酶阴沟肠杆菌的耐药性研究

【关键词】临床
摘要目的：研究我院产头孢菌素酶（AmpC酶）阴沟肠杆菌的检出率、耐药情况及ampC基因型。方法：收集临床分离的耐药阴沟肠杆菌15株；三维试验检测AmpC酶；NCCLS方法检测超广谱β内酰胺酶（ESBLs）；琼脂二倍稀释法测定MIC值；PCR扩增检测ampC基因及序列测定。结果：15株菌中8株菌（53.3%）产AmpC酶，3株菌（20.0％）产ESBLs。产AmpC酶的菌株除对亚胺培南全敏感外，对其它抗菌药不同程度耐药。5株菌的ampC基因与阴沟肠杆菌ECLC074的ampC基因100％同源，3株菌与之99％同源，2株菌的AmpC酶发生了1个氨基酸残基的改变。结论：产AmpC酶是阴沟肠杆菌对β内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一。阴沟肠杆菌ECLC074ampC基因是我院主要的阴沟肠杆菌ampC基因型。产AmpC酶的阴沟肠杆菌常呈多重耐药，亚胺培南是治疗此类菌所致感染的最有效药物。

关键词阴沟肠杆菌；头孢菌素酶；ampC基因；耐药
阴沟肠杆菌是一种重要的条件致病菌，随着新的β内酰胺类抗生素广泛应用于临床，此类菌的耐药问题越来越受到人们的关注。细菌通过产生大量的由染色体或质粒介导的β内酰胺酶（Bla）可使抗生素失活，包括头孢菌素酶（AmpC酶）、超广谱β内酰胺酶（ESBLs）、碳青霉烯酶等。AmpC酶由ampC基因编码，常见于阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、粘质沙雷氏菌等。为明确本地区医院感染阴沟肠杆菌的耐药机制，指导临床合理使用抗菌药，本文对产AmpC酶的阴沟肠杆菌的耐药表型和ampC基因进行初步研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株川北医学院附属医院2003年2月至2004年1月分离的耐哌拉西林阴沟肠杆菌15株，经梅里埃vitek32细菌鉴定系统鉴定。E.coliJM109由四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室提供。标准质控菌株大肠埃希氏菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603由四川抗菌素工业研究所提供。
1.1.2主要试剂哌拉西林（齐鲁制药厂），哌拉西林/他唑巴坦（上海先锋药业公司），头孢哌酮、头孢哌酮/舒巴坦（哈药集团制药总厂），头孢他定、头孢噻肟（哈尔滨誉衡药业有限公司），氨曲南、头孢吡肟（中美上海施贵宝制药有限公司），亚胺培南（美国默沙东药厂），头孢西丁(海南轻骑海药股份有限公司)，AMK(江苏吴中实业股份有限公司)，加替沙星(南京圣和药业赠)，环丙沙星（中国药品生物制品检定所）。头孢他定/克拉维酸纸片、头孢他定纸片、头孢噻肟/克拉维酸纸片/头孢噻肟纸片、头孢西丁纸片购于北京天坛药物生物技术开发公司。DNA凝胶回收试剂盒购于Vgene生物技术有限公司。基因组小量抽提试剂盒购自上海Sangon生物工程技术有限公司。pMD18TVector购于TaKaRa公司。
1.1.3主要仪器SakumaMITP细菌多点接种仪，MJResearchPTC150型PCR仪，GDS2000多功能凝胶成像和分析系统。
1.2方法
1.2.1Bla粗提液的制备及Bla的定性检测超声破碎法制备，Nitrocefin进行酶的定性检测。
1.2.2AmpC酶的检测通过三维试验
［1］判断是否持续高产AmpC酶。
1.2.3ESBLs酶的检测根据2002年NCCLS的规定进行。
1.2.4药敏试验采用琼脂二倍稀释法。根据2002年NCCLS的标准判断。
1.2.5基因组DNA的提取使用基因组小量抽提试剂盒，按说明操作。
1.2.6设计引物及PCR扩增检测ampC基因根据已知的阴沟肠杆菌ampC基因序列，设计引物
P1:5'gactcgctattacggaag3'
P2:5'ttactgtagcgcctcgag3'
引物由上海Sangon生物工程技术有限公司合成。以基因组DNA为模板扩增ampC基因。PCR扩增条件为：94℃3min，55℃1min，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸7min。扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.7ampC基因PCR产物的回收、TA克隆及重组质粒的酶切鉴定PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切下目的带，用DNA凝胶回收试剂盒回收DNA。取3μl回收DNA与含氨苄西林抗性基因的pMD18TVector连接，连接反应液转化至经氯化钙制备的E.coliJM109感受态细胞，经含氨苄西林的LB培养基进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落，过夜培养后，提取质粒经EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定。
1.2.8扩增产物的序列测定及同源性分析转化菌送上海基康生物公司进行DNA测序，测序结果在GenBank上用BLAST进行同源性检索分析。
2结果
2.1Bla的定性检测所试菌均产Bla。
2.2AmpC酶的检测结果所试菌中8株菌