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枯草芽孢杆菌的分离及筛选--

微生物设计性实验
枯草芽孢杆菌的分离及筛选

1实验目的
掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技
术和微生物形态观察技术。了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的
产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。
2实验原理
枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中
央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基
中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的
菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，
故名。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营
养体，残留芽胞。利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进
行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是
否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。
3实验材料
3.1选择培养基
本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。
配方：
牛肉膏5.0g
蛋白胨10.0g
氯化钠5.0g
可溶性淀粉10.0g
琼脂20g
蒸馏水1000ml
调整pH至7.2
配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。
3.2溶液或试剂
牛肉膏1.25g
蛋白胨2.5g
氯化钠1.25g
可溶性淀粉2.5g
琼脂5g
碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬
酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克，100毫升0.01NHCL。
3.4仪器或其他用品
平板培养皿10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干
燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌
吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。
4实验流程
倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→初筛→复筛→纯化→保存

枯草芽孢杆菌的分离及筛选--
枯草芽孢杆菌的分离及筛选--

5实验步骤
实验前准备
制备淀粉培养基，无菌水，在121摄氏度下灭菌20min。倒平板。把接种工具，培养基，
和其他用品全部在超净工作台上摆好，进行紫外线灭菌30min。
5.1制备土壤稀释液
取土样时最好选取如花坛等地方的土样，选好采样地点，铲产去表层5cm，取5～15cm
处。用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、
采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。振摇约二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞
分散。放入盛有99ml无菌水三角瓶中，常压80度的水浴处理样品1小时后，取出。
用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，
然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此
类推，制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤溶液。
5.2涂布
将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5三种稀释度，然后
用无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5三管土壤稀释液中各吸取0.2ml，小心地滴在对应平板培
养基表面中央位置。
用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆
方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～10min，使菌液浸入培养基。
5.3培养
将淀粉培养基平板倒置于30°C培养箱中培养1～3d。
5.4初筛
观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样的菌种单个菌落分别挑取少许细
胞接种到培养基上，置于30°C的培养箱中培养，若发现有杂菌，需要再一次进行分离纯化。
（如不能用肉眼更好的观察，可对其进行革兰氏染色，在显微镜下观察，与标准菌种比较。）
5.8复筛
测定其淀粉酶活。
5.8.1试剂和器材
1、试剂：
（1）碘原液：称取碘11克，碘化钾22克，加水溶解，稀释至500毫升。
（2）稀碘液：取碘原液2毫升，加碘化钾20克，稀释至500毫升，此试剂随配随用。
（3）2%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉2克，加5毫升蒸馏水，搅拌混和，再徐徐
倾入70毫升煮沸的蒸馏水中。继续煮沸2分钟，冷却至室温，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲
液（pH为6）
·）45.23克，柠檬酸（·）
（4）柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2OC6H8O7H2O
8.068克，加水溶解，稀释至1000毫升。
·）25克和重铬酸钾3.34克溶于10