母血浆胎儿游离ＤＮＡ检测ＳＲＹ基因.doc

母血浆胎儿游离ＤＮＡ检测ＳＲＹ基因
作者：杜丽,蒋玮莹,席红利
单位：中山大学中山医学院医学遗传学教研室；广东省妇幼保健院，广东广州
【摘要】【目的】建立一种比较稳定可靠的无创性获取胎儿遗传物质的方法。【方法】从孕妇外周血血浆中提取胎儿游离ＤＮＡ，以Ｙ染色体上的ＳＲＹ区域为靶序列进行扩增，扩增产物经ＤＮＡ测序进行确认，由此来确定我们获得的胎儿ＤＮＡ。【结果】我们利用获取胎儿游离ＤＮＡ的方法对１６例孕妇进行检测，１０例获得了成功，除１例未随访到结果之外，其他９例的随访结果和我们实验判断结果一致。【结论】我们初步建立的这种获得胎儿游离ＤＮＡ的方法具有可靠性，胎儿游离ＤＮＡ可以用于性连锁遗传病和单基因疾病的产前诊断。
【关键词】胎儿游离ＤＮＡ；母血浆；无创性产前诊断；ＳＲＹ基因
ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＦｅｔａｌＳＲＹＧｅｎｅＵｓｉｎｇＦｒｅｅＦｅｔａｌＤＮＡｉｎＭａｔｅｒｎａｌＰｌａｓｍａ∥
ＤＵＬｉ，ＪＩＡＮＧＷｅｉ-ｙｉｎｇ，ＸＩＨｏｎｇ-ｌｉ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｅｄｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＺｈｏｎｇｓｈａｎＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳＵＮＹａｔ-ＳｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００８０，Ｃｈｉｎａ；ＭａｔｅｒｎａｌａｎｄＣｈｉｌｄＨｅａｌｔｈＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００８０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｆｅｔａｌＳＲＹｇｅｎｅｂｙｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡｉｎｍａｔｅｒｎａｌｐｌａｓｍａ．【Ｍｅｔｈｏｄ】ＷｅｇｏｔｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡｆｒｏｍｍａｔｅｒｎａｌｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄａｎｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｔｈｅＳＲＹｓｅｑｕｅｎｃｅｔｏｍａｋｅｓｕｒｅｔｈｅｆｅｔａｌｇｅｎｄｅｒ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｔｏｖｅｒｉｆｙｔｈｅｔｒｕｔｈａｆｔｅｒｂｉｒｔｈ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｓｉｘｔｅｅｎｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎｗｅｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄ，１０ｏｕｔｏｆ１６ｓｕｂｊｅｃｔｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓ７ｍａｌｅｓａｎｄ３ｆｅｍａｌｅｓ．Ａｍｏｎｇｔｈｅｍ，９ｏｎｅｓｗｅｒｅｖｅｒｉｆｉｅｄｔｈｅｔｒｕｔｈｗｉｔｈｔｈｅｐｏｓｔｎａｔａｌｔｅｓｔ．１ｓｕｂｊｅｃｔｃｏｕｌｄｎｏｔｂｅｆｏｌｌｏｗｅｄｕｐ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】ＴｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｅｓｔｕｄｙｗａｓｒｅｌｉａｂｌｅａｎｄｔｈｅｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡｃａｎｂｅｕｓｅｄａｓｔｈｅｓａｍｐｌｅｏｆｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｓｅｘ-ｌｉｎｋｅｄｄｉｓｏｒｄｅｒｓａｎｄｓｉｎｇｌｅｇｅｎｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡ；ｍａｔｅｒｎａｌｐｌａｓｍａ；ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ；ＳＲＹｇｅｎｅ
传统的获取胎儿组织的方法，虽然目前仍被广泛应用［１，２］，然而无创伤性获取胎儿遗传物质进行产前诊断一直是临床追求的目标。胎儿游离ＤＮＡ的发现为产前诊断开辟了新的途径［３］，此后，胎儿游离ＤＮＡ很快在孕早期就开始应用于某些性连锁隐性遗传病、妊娠相关疾病、染色体病、胎儿ＲｈＤ血型检测等很多疾病的产前诊断中［４-１５］。我们初步建立了获取胎儿游离ＤＮＡ的方法，以Ｙ染色体上的ＳＲＹ区域为靶序列进行扩增，扩增产物经ＤＮＡ测序进行确认，由此来确定我们获得的胎儿ＤＮＡ。为下一步进行遗传性疾病的无创性产前诊断建立了技术平台。
１材料和方法
１．１临床资料
孕妇外周血标本均取自２００６年７月至２００７年３月，在中山大学附属第一医院妇产科做产前Ｇ６ＰＤ和地中海贫血筛查的标本。经知情同意，抽取了其中１６例孕妇的外周静脉全血各４ｍＬ，分离出２ｍＬ血浆提取胎儿游离ＤＮＡ。实验中有关胎儿的性别绝对保密，产后随访胎儿性别。另各取１名健康男性和未孕女性外周血２ｍＬ作为ＳＲＹ基因阳性和阴性对照。
１．２胎儿游离ＤＮＡ的提取和鉴定
利用ＱＩＡＧＥＮｍｉｎｉｂｌｏｏｄｋｉｔ参考试剂盒的说明并加以改进提取胎儿游离ＤＮＡ，以Ｙ染色体上的ＳＲＹ区域为靶序列进行扩增，扩增产物经ＤＮＡ测序进行确认，由此来确定我们获得的胎儿ＤＮＡ。实验中所用的内对照引物为Ｇ６ＰＤ基因的引物。根据扩增片段的大小选择相应浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察扩增结果。胎儿游离ＤＮＡ扩增ＳＲＹ阳性者测序。
２结果
２．１ＰＣＲ分析及随访结果
在我们所研究的１６位孕妇中，有１０例成功获得胎儿游离ＤＮＡ，经随访确认６例怀有男胎，３例怀有女胎，１例未随访到结果，未知胎儿性别。在每一次的实验过程中