玉米高效转基因体系的建立及其应用.doc

探讨玉米高效转基因体系的建立及其应用
摘要：植物转基因技术是我们改良其品质能够获得优良性状的转基因作物和功能的主要方法，通过采用这种方法进一步提高植物转基因的效率，为明确nas基因在玉米代谢中的作用打下了坚实的基础。
关键词：玉米；高效转基因；体系
1农杆菌介导的玉米转基因系统建立与优化
转基因技术在玉米育种中运用很广泛，植物基因工程为植物的遗传改良开拓了广阔的前景，转基因作物重新组合能够增强其抗逆性、抗病虫害和抗杂草性。植物基因工程是现代生物学研究的重要手段，如今转基因玉米的研究已取得显著进展，常用玉米转基因的方法已改良了玉米的某些性状，其中基因枪法是klein在1989年第1次使用其进行转化玉米，花粉管通道法是授粉后使外源基因沿花粉管渗入，根癌农杆菌介导玉米遗传转化成功率高，效果好，除此之外还有peg介导法、超声波法和电击法等。农杆菌介导转化玉米的研究历程经历了三个阶段：第一阶段证明农杆菌能够侵染玉米，第二阶段有转化细胞但没有获得转基因植株，第三阶段获得转基因植株且有分子杂交凭据。
农杆菌介导的转基因受体包括原生质体（转化效率高、嵌合体少，适宜各种转化系统）、愈伤组织，玉米胚性愈伤组织的诱导明显受到基因型的限制、丛生芽，每个不定芽都有形成幼苗的能力、悬浮细胞，基因型和培养基对悬浮细胞系的建立有影响、子房和幼穗，通过雌配子传递得到稳定的后代。
农杆菌介导遗传转化过程通过以下几个部分实现：即农杆菌在植物细胞上的吸附，然后通过ti质粒上的vir区被激活，再进一步是t-dna切割与t-dna复合物的形成，接下来由t-dna复合物进入植物细胞，最后再将t-dna整合到植物染色体上。目前主要采用添加诱导物的办法，不同时期的细胞或组织对于感染不同，不同菌株或载体对玉米的转化有影响，标记基因筛选出转化体。
通过改良菌株特征来实现玉米转基因系统优化，提高转化效率的目的。通过调控植物与农杆菌互作基因使转基因效率增加，达到系统优化的目的。
应用rnai原理及转基因技术分析玉米铁营养。rna干涉现象在植物矮牵牛中率先被发现，被认为是一种生物体的防御系统，为转录后水平基因沉默，能够抵御病毒及其他外来核酸的侵入，现广泛存在于原核细胞和真核生物中，以保持生物体基因组的稳定性。不同生物体中的rnai的分子机制相似，rnai介导的基因沉酞技术的应用，有效地抑制了靶向基因蛋白质，具有稳定．高效、快速等许多优点。可以利用网关系统构建rnai载体，这主要包括以下两个过程：将目的基因pcr片段引入中间载体，将目的基因从中间载体转移到表达载体；铁是影响植物生长和人类营养的一个微量元素，植物中铁吸收策略包括氧化还原策略和整合策略。尼克酰胺广泛存在于植物体内，在植物吸收铁的整合策略中起着很大作用。而在氧化还原策略中植物向根际土壤分泌氢离子以降低土壤ph值。
2实验与方法
实验材料包括植物材料，即野生型玉米和突变体玉米，采用的质粒和菌株以提高水稻转基因效率为益，以此构建玉米铁营养相关基因的干涉载体部分。酶和试剂采用宝生物工程(大连)有限公司的产品。采用合适的培养大肠杆菌及农杆菌培养基，通过rnai及转基因技术分析玉米铁营养相关基因。
在所需量的ctab抽提液中加入2—疏基乙醇，通过gatewaycloningsystem构建rnai载体，用pfu酶将pcr产物补平，用dna相关技术获得纯化的pcr产物，使用topocloning转化大肠杆菌，然后使用中间载体单克隆的验证及质粒的测序，采用碱裂解法获得质粒dna，pcr检测gst片段，用百分之一点五琼脂糖电泳检测pcr产物条带位置，最终载体单克隆的验证。
电击法将rnai载体转到农杆菌ehal05中，并进行农杆菌单克隆的验证，取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融，采用碱裂解法小量提取质粒dna。
在农杆菌介导法转化玉米时，通过玉米成熟胚为试验材料诱导愈伤组织，进行玉米种子的消毒，采取诱导与继代培养。在进行农杆菌培养时注意吸取新鲜培养的农杆菌菌液，然后实施共培养和抗性愈伤组织的选择，注意在整个过程中在共培养基上平铺一张无菌滤纸，将愈伤组织取出放入50ml无菌离心管，抗性愈伤组织的诱导分化和生根中，要注意放入生根培养基中壮苗7-14天。玉米转基因所用培养基配方包括成熟胚愈伤组织诱导／继代培养基、共培养基、选择培养基每升含量及分化培养基配方，生根培养基配方和悬浮农杆菌感染愈伤组织的培养基配方。然后进行转基因苗的锻炼，移栽及检测，注意要洗去琼脂，移栽到温室进行溶液培养；转基因植株的分子鉴定又包括设计rt-pcr检测的引物，植物总rna的提取，逆转录获得edna。利用玉米aetin基因的上下游引物进行pcr反应，利用目的基因的rt-pcr引物进行pcr反应。
3超表达拟南芥提高玉米侵染效率
农杆菌介导法获得超表