细菌纤维素-纳米银复合材料的制备及其抗菌性能研究.doc

细菌纤维素/纳米银复合材料的制备及其抗菌性能研究
摘要：细菌纤维素（bacterialcellulose,bc）是一种由微生物合成的高纯度纤维素，超细纤维网络结构使其具有高比表面积、高持水能力以及良好的生物相容性和生物可降解性，被认为是一种潜在的“理想”医用敷料材料。然而，细菌纤维素本身不具有抗菌性能，难以应对细菌感染的伤口。纳米银是一种广谱抗菌剂。因此本文以细菌纤维素为模板，采用环境友好的化学还原剂抗坏血酸为还原剂，原位制备细菌纤维素/纳米银复合材料。同时分别采用抑菌圈法和最小抑菌浓度法对复合物的抗菌效果进行评价。
关键词：细菌纤维素纳米银抗菌创伤敷料
一、引言
细菌纤维素是一种由微生物合成的高纯度纤维素，其微纤维直径只有40-60nm，是自然界中天然存在的精细纳米材料。超细纤维网络结构使其具有高比表面积、高持水能力以及良好的生物相容性和生物可降解性，被称作“大自然赋予人类的天然生物医用材料”[1]。大量研究和临床试验表明，细菌纤维素基创伤敷料对于烧伤烫伤以及慢性溃疡疾病具有良好的治愈效果，是一种极具潜力的“理想”创伤敷料材料[2]。
然而，细菌纤维素本身不具有抗菌性能，难以应对细菌感染的伤口。金属银及其化合物是目前最常用的无机抗菌剂，尤其适用于治疗烧伤烫伤以及慢性溃疡创伤[3]。因此，以细菌纤维素为载体负载纳米银粒子将有望获得具有高效保湿抗菌功能的“理想”医用创伤敷料。孙东平等以细菌纤维素为载体，甲醛为还原剂采用液相化学还原法合成载银细菌纤维素复合材料，所得银纳米粒子平均粒径在45nm左右，对大肠杆菌、酵母菌和白色念珠菌等都有理想的抗菌效果[4]。marques等分别以细菌纤维素和普通植物纤维为基体，采用nabh4原位还原agno3的方法在纤维素膜上合成纳米银单质，结果表明细菌纤维素纤维的银负载量可达到植物纤维的50倍以上，并且对ag+具有更持久的控释作用，是一种良好的纳米银合成基质[5]。上述研究大多采用nabh4、甲醛等化学试剂为还原剂，这些试剂通常具有较高的人体毒性，反应结束后很难解决试剂在纤维膜内的残留问题，尤其不适合应用于生物医用材料产品的制备。据此，我们提出，以细菌纤维素为模板，摒弃有毒化学还原试剂，采用环境友好的抗坏血酸为还原剂，原位制备细菌纤维素/纳米银复合材料。
二、材料与方法
（一）实验材料
木醋杆菌（acetobacterxylinum）：本实验室保藏。agno3、抗坏血酸购买于国药集团化学试剂有限公司。其它试剂若无特殊说明，均为市场可售。
（二）细菌纤维素膜的制备和纯化
以木醋杆菌为菌种，将活化后的菌种接种至种子培养液中，在30℃和160rpm的摇床中培养24h。按6%的接种量接种于发酵培养基中，30℃恒温培养箱中静置培养8d，得细菌纤维素膜。培养基组成为麦芽糖25g/l，蛋白胨3g/l，酵母浸膏5g/l，ph值为5.0，121℃灭菌20min。
将bc膜取出用去离子水反复冲洗，再浸泡于0.1%的naoh溶液中以去除细菌纤维素膜中的菌体及残留培养基，80℃处理6h至膜呈乳白色半透明。最后用去离子水充分洗涤，直至洗液成中性。
（三）细菌纤维素/纳米银复合材料的制备
将上述bc膜浸泡于一定浓度的硝酸银溶液中，在30℃恒温水浴锅中100rpm震荡12h。然后将膜取出放入10mm的抗坏血酸溶液中，在磁力搅拌下冰浴还原6h。然后取出用去离子充分洗涤，得细菌纤维素/纳米银复合材料。
（四）含银量的测定
将制备的复合物样品干燥后剪碎，准确称取一定质量溶解于hno3溶液中。采用原子吸收法测定其银含量。
（五）抗菌性能的测定
（1）抑菌圈法
以金黄色葡萄球菌为模型菌。具体方法为：将金黄色葡萄球菌从斜面接种到种子培养基中，37℃恒温培养12h得种子液。吸取0.1ml种子液至固体平板培养基上，涂布均匀。将载银细菌纤维素膜平铺在平板中央，37℃恒温倒置培养24h。然后测量其抑菌圈大小，并以不载银的纯细菌纤维素膜为对照组。抑菌带宽度定义为：抑菌带半径平均值与样品膜半径平均值之差。
（2）最小抑菌浓度法（mic）
以金黄色葡萄球菌为模型菌，采用mic法定量评价复合物的抗菌效果。具体方法为：将10个灭菌的含一定量培养基的三角瓶分别编号1-9号，在培养基中放入1-9片载银细菌纤维素膜制成不同含银量培养基。然后，取107cfu/ml的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml接种于上述1-9号三角瓶中，于37℃恒温培养24h。
培养结束后，分别从上述三角瓶中取出0.1ml培养液，将其涂布到琼脂平板上，每个样品做三个平行，于37℃恒温培养箱中倒置培养24h，观察菌落的生长情况。以不长菌的最低浓度为最小抑制浓度（mic）。
三、结果与讨论
（一）细菌纤维素/纳米银复合材料的制备
目前化学法还原制备纳