近红外荧光成像技术——定量Western Blot的新标准.pdf

近红外荧光成像技术
-定量WesternBlot的新标准

基因有限公司李春燕

化学发光检测近红外荧光检测

680laser800laser

11/10/2012
化学发光检测红外荧光检测

酶促化学反应，无法准确定量信号恒定，准确定量

暗房曝光荧光成像

膜上无法直接观察到Marker膜上直接观察到Marker

两种蛋白检测需Strip两种蛋白同时检测

11/10/2012

近红外荧光成像技术

•荧光——准确定量、线性范围宽广
•红外——背景低、信噪比高
•双色——同时检测、同时输出
荧光－准确定量

化学发光荧光

•动态信号－信号随时间变化•静态信号－信号不随时间变化
•信号不与目标蛋白浓度成比例关系•信号和目标蛋白浓度成比例关系

Saturation

INTENSITY

Background
0,00,0
TIMETIME

Highconcentration/Mediumconcentration/Lowconcentration/
signalsignalsignal
红外荧光VS化学发光
定量线性范围更宽

化学发光法近红外荧光法

•近红外荧光法能检测到0.6pg的蛋白（灵敏度高）
•近红外荧光成像呈现一个很好的线性（定量准确）
MooseImaging–Signal/Background

Background
HighS/B

LowS/B
近红外：低背景，高信噪比

近红外荧光的波长范围在700-800nm之间，避开了NC膜、PVDF
膜微孔板等耗材的本底信号，提高了检测的信噪比和相对灵敏度

11/10/2012
红外荧光－直接检测

Infrareddye(IRD800,Alexa680)

膜上抗原一抗结合红外标记的二抗

Odyssey直接扫描
不需要底物
不需要底片/暗室
信号持久
Odyssey—双色同时检测

•两套独立激发检测系统
•700通道：680nm激发720nm检测
•800通道：780nm激发820nm检测

800nm700nm

Overlay
双色－定量western检测

Targetprotein
Anti-rabbit800channel
Normalizertarget
Anti-mouse700channel

杂交条件均等，结果同时输出，直接比对

11/10/2012
双色－蛋白磷酸化

—+EGF—+EGF—+EGF

800nm700nm700and800
channelchannel
nm
ERKphosphoERKResultsOverlaid

EGF刺激后A431细胞，ERK1andERK2(p44/42MAPkinases)磷酸化情况,一抗分别是兔抗ERK抗体和小鼠
抗磷酸化ERK抗体,二抗用抗兔的IRDye800标记的抗体(green),和抗鼠的Alexa680标记的抗体(red)。叠加后
为黄色，黄色的深浅即代表了磷酸化水平的高低，并且可以通过软件进行准确的量化分析。

NIREMSA-告别同位素！
（体外核酸和蛋白相互作用）

700nmChannel

700and800Overlay

DNA-ProteinComplex

UnboundDNAIRDye800
800nmChannel

UnboundDNAIRDye700

BindingofT7RNAPtotwoDNAfragmentscontainingtheT7promoter
sequence,labeledwitheitherIRDye700(red)orIRDye800(green).

11/10/2012
In-CellWesternAssay

细胞处理效果和药物筛选的最佳选择
In-CellWesternAssay
快速、高通量、重现性好

膜上WesternIn-CellWestern

细胞培养√√
细胞刺激√√
固定和透化√
细胞裂解√
上样√
电泳√
转膜√
孵育抗体√√
成像√√
通量12sample/Gel96或384/Plate

11/10/2012
NIR-小动物活体成像

低GFPRFPIRDye®高
背信
景噪
比

•组织和细胞对近红外波长的光信号吸收最低
•红外波段，光的散射更低
•在近红外波长范围，自发荧光更低

11/10/2012
波长特异性激光器作为激发光源

SourceExcitationQualityExcitationBackgroundOverall
LightofLightEfficiencyNoisePerformance

800nm800nm

800nm800nm

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