人溶菌酶转基因山羊乳腺生物反应器的研制.doc

人溶菌酶转基因山羊乳腺生物反应器的研制
【摘要】：本研究为获得乳汁中高效表达人溶菌酶(hLYZ)的转基因山羊，分别以人的α-乳清白蛋白、山羊β-酪蛋白、牛as1-酪蛋白和牛β-乳球蛋白基因为调控区构建了人溶菌酶基因组DNA和cDNA的5种乳腺特异表达框架(pAAlyzc、pBClyzc、pINSlyz、pBClyzg、pBLGlyz)。通过与pLNK共转染或独立转染的方式将此5种表达构件转染入山羊胎儿成纤维细胞内。经PCR和Southern-blot检测，从分隔良好的G418抗性克隆中筛选出了整合有这些构件的单克隆细胞。以转基因整合的细胞株为供核细胞，进行山羊体细胞克隆。共计投入489头山羊，最终获得了22只成活的克隆山羊，分别为pAAlyzc4只、pBClyzc4只、pINSlyz3只、pBClyzg6只、pBLGlyz6只。整合鉴定表明，pAAlyzc的4只山羊和pINSlyz3只山羊均不携带外源基因，其他克隆山羊均包含有预期的外源基因。通过人工诱导泌乳的乳中hLYZ表达分析表明：整合有pBLGlyz基因的克隆山羊在乳汁中高效表达了人溶菌酶，其中BLGl和BLG2的表达水平分别为3g／L和4g／L。自然泌乳后，乳汁中仍然可维持人溶菌酶的高效表达。经SP-Serphrose离子交换层析和超滤相结合纯化了转基因山羊乳汁中的人溶菌酶，纯度达98％以上。溶壁微球菌溶解实验测定该溶菌酶的比活与天然人的溶菌酶活性相当，为1.4-1.6×10~5IU／mg。重组人溶菌酶的性质鉴定表明：N-端10个氨基酸测序与天然人的溶菌酶完全一致；具有很好的热稳定性和pH稳定性；具有广谱的革兰氏阳性菌抗菌活性，1mg／ml时对测定的40株临床分离菌的抑制率均在90％以上。以上结果表明：该研究首次获得了乳汁中可表达克级水平的人溶菌酶转基因山羊；重组人溶菌酶能够在转基因山羊乳腺中进行持续、高效的表达且不对受体山羊的生理功能产生不良影响。转基因山羊乳腺中表达的人溶菌酶具有同天然人乳溶菌酶相近的理化性质和生物学活性，可供大规模商业化开发。同时也表明体细胞体外遗传修饰结合核移植技术是高效制备转基因家畜的方法，可用以批量生产转基因家畜。【关键词】：
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：Q789
【目录】：摘要2-3前言3-41材料与方法4-101.1试验材料4-51.1.1菌种和细胞株41.1.2基因和质粒载体41.1.3主要试剂材料41.1.4主要仪器设备4-51.1.5主要试剂的配制51.2人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体的构建5-61.3共转染山羊的胎儿成纤维细胞以及抗性克隆的筛选鉴定61.4外源基因的整合鉴定6-71.5体细胞核移植7-81.5.1卵母细胞制备与受体羊的同步71.5.2.供核细胞的饥饿处理71.5.3.重构卵的制备与激活7-81.5.4.重构卵的包埋、回收与发育胚胎的移植81.6转基因山羊的诱导泌乳和重组人溶菌酶的表达检测81.7重组人溶菌酶的纯化8-91.8溶菌酶的活性检测91.9重组人溶菌酶的N-端氨基酸测序91.10其他未述及的方法均参照参照《分子克隆试验指南》9-102结果10-202.1人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体的获得10-112.2体细胞克隆用转基因单克隆细胞的获得112.3转基因克隆羊的获得11-132.4转基因山羊乳汁中重组人溶菌酶的表达检测13-162.5转基因山羊乳汁中重组人溶菌酶的纯化与性质测定16-203讨论20-253.1转基因家畜的乳腺是廉价大量生产重人溶菌酶的理想场所20-223.2体细胞遗传修饰结合核移植技术是制备转基因家畜的高效方法22-254结论25-26致谢26本论文购买请联系页眉网站。