分子荧光光谱法.ppt

分子荧光光谱法实验Molecularfluorescencespectroscopy光致发光（Photoluminescence）:荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象，称为光致发光。
特点：
★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个数量级；
★线性范围宽；
★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光；
★应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。
基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光谱法。一。目的和要求二、荧光光谱法基本原理2.激发态分子的失活:激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。无辐射跃迁
☆振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。
☆内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。
☆系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。
☆外转换：激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。辐射跃迁:
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8~10-11s。由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为106~109s-1。
辐射能量传递过程

荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为‘2的荧光；10-7～10-9s。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；‘2>2>1；
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱

1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。3.激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b.发射光谱的形状与激发波长无关
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如‘2)。
c.镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。2、激发光谱和荧光光谱3、荧光与结构的关系
（1）电子跃迁类型
发射π*→π跃迁比π*→n跃迁更常见
（2）共轭效应芳香族化合物的荧光最常见且最强，大多数未取代芳烃在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程度增加，荧光峰红移，Φ↑。简单杂环化合物不发荧光，但具有稠环结构的杂环化合物都发荧光。
（3）平面刚性结构效应有刚性结构的分子容易发荧光，刚性和共平面性的增加有利于荧光发射。化合物名称三。实验方法2.标准曲线制作精密量取储备液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml分别置于50ml量瓶中，加0.5mol/LHAc溶液至刻度，摇匀。其浓度相当于10,20,30,40,50mg/L.在Ex=367nm,Em=505nm处测定荧光强度，并建立标准曲线。3.氧氟沙星片含量测定取左旋氧氟沙星片一片，精密称定后置于100ml量瓶中，加0.05mol/LHCl溶液10ml充分振摇溶解后，加水稀释至刻度，摇匀。静置后干过滤。精密量取滤液3.00ml置于100ml量瓶中，用0.5mol/LHAc定容至刻度，摇匀。在Ex=367,Em=505nm处测定荧光强度，根据标准曲线计算氧氟沙星片的含量氧氟沙星片含量=(Cx3.30/ms)x100%思考题1.干扰荧光分光光度法测定的因素有哪些？2.应如何确定被测物的激发和发射波长？3.CRT型荧光光谱仪操作规程一、标准曲线的测定和绘制1.点击标准曲线，进入标准曲线界面2.在石英比色皿中，装入第一个标准溶液(10mg/L)，放入样品室内3.输入浓度值10mg/L,点击测试4.电脑上提示对话框波长是否到确定，点击确定5.待电脑上显示荧光值后，点击添加按照上述步骤，再分别测试20mg/L,30mg/L,40mg/L,50mg/L的荧光值，记录不同浓度的荧光值6.点击拟合，电脑上会显示拟合曲线及相关参数，记录相关参数二、未知样品浓度的测定1.点击样品浓度，进入未知样品浓度测试的界面2.点击标准曲线，屏幕上会显示刚做过的标准曲线3.在石英比色皿中，装入未知样品浓度的溶液，放入样品室内4.点击测试5.记录未知样品测试的荧光值及浓度