酶活性测定方法.doc

体系一
酶和蛋白质提取
消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加50L以下处理：（1）无菌水，对照；（2）浓度为1000g/mlGA3；（3）浓度为1×104spores/mlP.expansum孢子悬浮液；（4）浓度为1000g/mlGA3+浓度为1×104spores/mlP.expansum孢子悬浮液。处理后湿纱布覆盖并用PE塑料膜密封作保湿处理。贮藏于常温（20-25℃）下。分别在0、12、24、36和48小时取样进行测定酶活性。取样时沿伤口用刀小心切下1g果实组织，加入10mL冷(4℃)的50mmol/L磷酸缓冲液（PBS）内含1.33mmol/LEDTA和1%PVPP缓冲液(pH7.8)。研钵加入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。取上清液供酶活性和蛋白质含量用。
蛋白质含量测定
试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液。
8.1.2蛋白试剂考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
8.1.3乙醇；磷酸（85％）。
试验方法：分别取牛血清白蛋白标准溶液（1000μg／mL）0,、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL，无菌水补至100μL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，作为标准溶液；
分别取标准溶液和上清液（试验7中得到）400μL加到酶标板，以无菌水置零，测定OD595；
酶活的测定
9.1试验材料和试剂
9.1.1氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。
9.1.2Na2HPO4-12H2O；NaH2PO4-2H2O。
9.1.3磷酸缓冲液PBS配制
母液：0.2MNa2HPO4：称取71.6gNa2HPO4-12H2O，溶于1000ml水；
0.2MNaH2PO4：称取31.2gNaH2PO4-2H2O，溶于1000ml水。
按表2配制0.2M的PB（mL），最后稀释至所要的浓度
表SEQ表格\*ARABIC1不同pH值PBS的配制
pH0.2MNa2HPO4（mL）0.2MNaH2PO4（mL）6.426.573.57.062387.891.58.59.2试验仪器
9.3.1200μL、1000μL移液枪，eppendorf；
9.2.2酶标仪，；
9.2.3酶标板，JETBIOFIL
9.3试验方法
9.3.1超氧物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）活性的测定
SOD采用氮蓝四唑（nitro-bluetetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）[6]。反应步骤为：取200μl粗提液，加入3.7mlNBT反应液〔50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液（PBS）配制的含77.12μmol/L氮蓝四唑,100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保温2分钟后加入100μl核黄素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸缓冲液中含80.2μmol/L核黄素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定A560。以不照光的管做空白。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50％为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。
SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)式中，Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg）。
9.3.2过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性测定
CAT活性参照Aebi(1984)[7]的方法进行测定。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。400μL反应液含50mmol/L的PBS(pH7.0)，30mmol/L的H2O2和50µL粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240nm吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25℃，pH7.0条件下1分钟分解1μmol过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
9.3.4多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定
PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）[8]。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。350µL反应液（用50mmol/