氨基酸组成分析.ppt

第三章氨基酸组成分析氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子质量在75～
200Da之间，其化学通式为R-CH(NH2)-COOH，在生物体
内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生物来源的多肽中出
现D型氨基酸。
氨基酸分析技术的发展始于1820年，由Braconnot最早
将甘氨酸从白明胶水解物中分离出来，但直到21世纪，用
化学方法或微生物方法测定氨基酸，仍是一项持续数周或数
月的繁琐的工作。
色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。
1941年，Martin等运用色层法分析氨基酸，主要采用乙酰
化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量；随后，Moore、
Stein应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸，在1958年，
Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析
仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段，至今仍是
经典的方法。第一节氨基酸组成分析的目的第二节蛋白质的水解方法影响氨基酸分析结果的三大因素是：水解、衍生、色谱。
水解是第一步，水解的完全与否对结果影响很大。在实验中
通常采用一些标准蛋白质，如细胞色素c(Cytc)、核糖核酸
酶(RNase)或胰岛素(insulin)为标样进行水解、衍生和色
谱分析来计算回收，从而考验蛋白质分析的可靠程度和评价
方法的适用性。
但由于各种蛋门质含有的氨基酸多少不同，并且每一种氨
基酸的量也不一样，有的氨基酸含量可多到十几个，有的
氨基酸含量只有1～2个，这影响到氨基酸的回收。生物应
用公司（ABI）曾设计过一种“测试肽”，即人工合成18种不
同氨基酸的肽(除Gln、Asn外)，这样每种氨基酸出现的频
率都是1，用此肽来校正回收，看来机会均等，是一种可以
采纳的方法，但在实际样品中，不太可能出现这种理想情
况。第三节特殊氨基酸的保护和定量3．碱
用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护色氨酸不被破坏。
4．酶
蛋白酶水解法有时也有应用，其优点是条件温和，对天冬酰胺和谷氨
酰胺及色氨酸均无破坏作用，但酶水解法往往不完全，必须用酸水解法
校正。
5．光谱法
分光光度法和二阶微分光谱法可测定色氨酸，前者应用较早，在蛋白
质分子中，如不含半胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸，根据其
在6mol/L盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收，测定色氨酸和酪氨酸的含
量，此经验公式只适用于色氨酸对酪氨酸的比值为0.2～1时的情况。酪
氨酸常被用来确定蛋白质中芳香族氨基酸的含量，计算公式复杂。
HewlettPackard公司推出的DAD检测器配合其化学工作站软件，
能较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。
虽然蛋白质和多肽的氨基酸分析法对大多数氨基酸是快速、准确和灵
敏的，但在半胱氨酸定量时仍遇到很大困难，解决这个问题的途径有两
种，一种是还原烷化法，另一种是氧化法。(1)还原烷化法
产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化试剂包括4—乙烯
吡啶和碘代乙酸。但这些方法有缺点，为了确保试剂接近巯
基，还原和氧化通常在变性剂存在下进行，多余试剂和变性
剂要用HPLC、沉淀法或透析去除，每一步都可能造成样品的
损失，特别是对于小肽和微量样品，而且烷化反应如果不仔
细控制条件，可能导致半胱氨酸以外其他残基的衍生。
(2)氧化法
氧化反应被用来转化半胱氨酸和胱氨酸成为半胱磺酸，过
甲酸氧化反应的缺点是它会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸
会转变成甲硫氨酸砜，酪氨酸会降解。为克服这一缺点，必
须准备能分析两次的样品量，一次提供半胱氨酸数据，另一
次则提供其他氨基酸的组成数据。第四节氨基酸组成原位分析第五节衍生方法及原理(1)茚三酮法
Spackman等人最早将茚三酮试剂运用到氨基酸组成分
析上。离子交换层析后，各种氨基酸与茚三酮反应形成紫色
化合物，最大光吸收在570nm，摩尔消光系数2X104，茚
三酮和二级胺(脯氨酸和羟脯氨酸)形成黄色产物，在
440nm检出，摩尔消光系数3X103。目前此法的灵敏度可
达100pmol，但茚三酮试剂易氧化，必须隔绝空气避光保
存，试剂本身黏性大，需要有个柱后混合器才能与氨基酸充
分反应，对仪器要求较高。(2)柱后荧光胺法
20世纪70年代合成了荧光胺，它能在室温下迅速和一级
胺发生反应，其荧光产物的激发波长Ex390nm，发射波长
Em475nm。次级胺可以用N-Chlorosuccinimide(NCS)
氧化生成相应的初级胺后再与荧光胺反应而检出。
(3)邻苯二甲醛(OPA)法
OPA最早是被作为柱后衍生试剂而引进的，后来也逐渐应用于柱前反
应中。OPA能在还原剂巯基乙醇存在下和一级胺产生具有很强荧光的异
吲哚衍生物，反应迅速，在室温下1min即可完成，反应络合物的
Ex340～360nm，Em455nm，灵敏度比茚三酮法高，在OPA中加入
SDS或表面活性剂Brij—35