荧光原位杂交fish.doc

2.9荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)
非同位素原位杂交技术可用于测定细胞或组织中特异性转录物定位及其表达的相对水平。它是用一标记生物素或地高辛的非放射性探针和所制备样本的RNA进行杂交，非同位素探针通常通过荧光或酶法予以检测。FISH试验用水须以DEPC处理，所用溶液的配置均使用DEPC处理过的水，以抑制RNA酶活性。
(1)杂交探针的制备
实验中针对AOB、NOB和Anammoxbacteria的寡核苷酸探针如表2-9所示，合成。全菌数的检测采用DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)染色，呈蓝色，双重染色后可以在显微镜的同一视野下观察可以检出细菌的丰度。探针由Invitrogen生物科技有限公司合成。

表2-9FISH中所使用的寡核苷酸探针
Tab.2-9OligonucleotideprobesusedforFISHinthisstudy
名称染料甲酰胺
(%)核苷酸序列(5‘-3’)目标菌参考
文献PLA46Cy5(红)30GACTTGCATGCCTAATCCPlanctomycetalesAmx820Cy5(红)40AAAACCCCTCTACTTAGTGCCCAnaerobicammonium-oxidizingbacteriaCandidatus
“Brocardiaanammoxidans”andCandidatus“Kueneniastuttgartiensis”NSO190FITC(绿)55CGATCCCCTGCTTTTCTCCBetaproteobacterialammonia-oxidizingbacteriaNEU653FITC(绿)40CCCCTCTGCTGCACTCTAMostofthehalophilicandhalotolerantNitrosomonasspp.Nit3Cy3(蓝)40CCTGTGCTCCATGCTCCGNitrobacterspp.Ntspa712Cy3(蓝)50CGCCTTCGCCACCGGCCTTCCMostmembersofthephylumNitrospiraeEUB338FITC(绿)20GCTGCCTCCCGTAGGAGTManybutnotallbacteriaEUB338IIFITC(绿)20GCAGCCACCCGTAGGTGTTobeusedincombinationwithprobeEUB338EUB338IIIFITC(绿)20GCTGCCACCCGTAGGTGTTobeusedincombinationwithprobeEUB338
(2)药品与试剂
1)4%多聚甲醛固定液
加入略少于2/3最终体积的水，加热至60℃。称出制备4%溶液的多聚甲醛的量，并一边搅拌一边加入水中，加盖放入通风橱内，保持60℃并搅拌，用巴斯德吸管加入一滴2MNaOH，使溶液澄清，停止加热并加入1/3体积的3PBS，用HCl调pH值至7.2，加水至最终体积，使用Millipore滤膜过滤。冷却至室温，现用现配。
2)1明胶浸泡溶液，4℃。
在70℃水中溶解明胶配置成0.5%(m/V)的溶液，冷却至室温，加入硫酸钾铬至0.05%，于冰水浴冷却至4℃，立即使用。
3)杂交缓冲液
5MNaCl，10%SDS，1MTris-HCl，甲酰胺浓度视探针类别确定。
4)杂交清洗液
5MNaCl，10%SDS，1MTris-HCl，甲酰胺浓度视探针类别确定。

(4)生物膜/活性污泥的预处理
1)提取1ml生物膜/活性污泥于1.5ml离心管内，超声处理1min，10000g下离心5min；
2)弃去700ul上清液，加入900ul的4%多聚甲醛，涡旋30s以混合样品，4℃下静置2h；
3)10000g下离心5min，弃去上清液，加入1ml1PBS缓冲液；
4)10000g下离心5min，弃去上清液，加入500ul1PBS缓冲液和500ul99.5%乙醇，-20℃下保存。
(5)明胶包被载玻片
1)将载玻片在10%KOH溶液中浸泡1h，取出后用灭菌水冲洗干净，晾干；
2)将载玻片在70℃明胶溶液中浸渍几下，空气中晾干，4℃下保存。
(6)荧光原位杂交
1)混合预处理的生物膜/活性污泥样品，吸取5ul样品涂于明胶包被的载玻片上，空气中晾干；
2)依次在50%、80%、99.5%的乙醇中各浸渍3min，取出后空气中晾干；
3)取9ul杂交缓冲液和1ul探针轻轻混合后，滴加到固定样品的载玻片上，水平放置玻片于杂交湿盒中，40℃下杂交3h；
4)取50ml杂交清洗液于48℃水浴中预热，将去离子水于4℃下保存备用。
(7)未结合探针的清洗及结果观察
1)杂交结束后，用48℃预热的杂交清