菌种鉴定方法.docx

实验步骤：菌种鉴定工作是各类微生物学实验室都经常遇到的基础性工作。不论鉴定对象属哪一类，其工作步骤都离不开以下三步：①分离纯化菌种；②测定一系例必要的鉴定指标；③查找权威性的鉴定手册。一、经典分类鉴定方法群体：菌落形态，在半固体或液体培养基中的生长状态等*形态个体：细胞形态，染色反应，各种特殊构造等*营养要求：能源，碳源，氮源，生长因子等*生理、生化反应酶；产酶种类和反应物性等*代谢产物：种类，产量，显色反应等*经典指标生态特性：生长温度，对氧的需要，宿主种类等*生活史特点*血清学反应*噬菌体的敏感性*其它二、现代分类鉴定方法*近年来，随着分子生物学的发展和各项新技术的广泛应用，促使微生物分类鉴定工作有了飞速发展。对微生物鉴定工作来说，已从经典的表型特征的鉴定深入到现代的遗传学特性的鉴定、细胞化学组分的精确分析以及利用电子计算机进行数值分类研究等新的层次上。*（一）微生物遗传型的鉴定*DNA是除少数RNA病毒以外的一切微生物的遗传信息载体。每一种微生物均有其自己特有的、稳定的DNA成分和结构，不同微生物间DNA成分和结构的差异程度代表着它们间新缘关系的远近。因此，测定每种微生物DNA的若干重要数据，是微生物鉴定中极其重要的指标：1.DNA的碱基组成(G+Cmol%)*每一个微生物种的DNA中GCmol%的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化，而且在同一个属不同种之间，DNA中GCmol%的数值不会差异太大，可以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的GCmol%范围。DNA中GCmol%分析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌DNA中GC含量的变化范围一般在25％～75％；而放线菌DNA中的GC比例范围非常窄(37％～51%)。一般认为任何两种微生物在GC含量上的差别超过了10％，这两种微生物就肯定不是同一个种。因此可利用G+Cmol％来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。值得注意的是，亲缘关系相近的菌，其G+Cmol％含量相同或者近似，但G+Cmol％相同或近似的细菌，其亲缘关系并不一定相似，这是因为这一数据还不能反映出碱基对的排列序列，而且如放线菌的DNA的GCmol%在37～51之间，企图在这么小的范围内区分放线菌的几十个属显然是不现实的。要比较两种细菌的DNA碱基对排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸杂交试验。1.DNA的碱基组成(G+Cmol%)*1）每个生物种都有特定的GC%范围，因此后者可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25--75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。*2）GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的亲缘关系。*3）使用原则：*G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物，它们应该具有相似的G+C含量，若不同生物之间G+C含量差别大表明它们关系远。但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。1.DNA的碱基组成(G+Cmol%)*同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在4～5%以下；同属不同种的差别应低于10～15%。所以G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。*若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。*在疑难菌株鉴定、新种命名、建立一个新的分类单位时，G+C含量是一项重要的，必不可少的鉴定指标。其分类学意义主要是作为建立新分类单元的一项基本特征和把那些G+C含量差别大的种类排除出某一分类单元。2.核酸的碱基组成和分子杂交：*与形态及生理生化特性的比较不同，对DNA的碱基组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。DNA-DNA杂交*DNA杂交法的基本原理是用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链DNA，然后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。如果两条单链DNA的碱基顺序全部相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率为100%。如果两条单链DNA的碱基序列只有部分相同，则它们能生成的“双链”仅含有局部单链，其杂合率小于100%。由此；杂合率越高，表示两个DNA之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。如两株大肠埃希氏菌的DNA杂合率可高达100％，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的DNA杂合率较低，约有70％。G+Cmol％的测定和DNA杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途径，解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题，但对于许多属以上分类单元间的亲缘关