Chelex-100法提取生物检材中的DNA.doc

Chelex-100法提取生物检材中的DNA
一、原理当检材较少时或者基因分型只需要少量的DNA时，可以用Chelex-100提取方法提取DNA。Chelex-100是一种化学整合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力．能结合许多可能影响一步分析的其他外源物质。通过离心除去Chelex-100颗粒，使这些与Chelex-100结合的物质与DNA分离，防止结合到Chelex中的抑制剂或杂质带到PCR反应中，影响下一步的DNA分析，并通过结合金属离子，防止DNA降解。二、实验目的掌握各种法医学生物检材DNA提取方法。三、仪器设备干热器、恒温水浴箱、高速离心机、离心管四、试剂Chelex-100法提取生物检材所需试剂的配制1．5％Chelex-100（w/v）称取5克Chelex-100，加100ml灭菌纯水，放4℃保存。2．10％SDS称取10克优级纯的SDS，加纯水到100ml溶解，室温保存。3．5mg/mlPK酶（蛋白酶K）称取5mgPK酶，溶于1ml灭菌纯水中，－20℃保存。4．1MDTT(二硫苏糖醇)称取154.3mgDTT加1ml灭菌纯水溶解，－20℃保存。五、实验方法---Chelex-100法1.全血1)取3～10μl全血加到0.5ml离心管中，加人500μl纯水，剧烈振荡，室温下放置15分钟。2)13,000rpm离心3分钟，去上清，收集沉淀。（必要时可用蒸馏水反复洗沉淀物，直至无色或血色素很少）。3)沉淀中加入200μl5％Chelex-100溶液（5％Chelex-100为悬浊液，使用前要充分振摇，使Chelex-100颗粒悬浮），在振荡器上反复振荡，放入56℃保温30分钟以上。4)取出后振荡，100℃保温8分钟，振荡后，13,000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增，或放4℃保存备用。2．血斑1)剪取约0.5cm2的血斑，加到0.5ml的离心管中，加入500μl纯水，剧烈振荡，室温放置15分钟。13,000离心3分钟，去上清。（可用纯水反复洗至无色，载体不需去除，始终留在离心管中。）2)以下步骤同全血的提取方法。3．混合斑1)取适量含有混合斑的检测，剪碎后放入5ml小烧杯中，加入3ml纯水、300μl10%SDS及150μl5mg/ml的PK酶，用牙签搅拌后，放入37℃水浴6小时以上（最好过夜）。2)将水浴好的检材移入1.5ml离心管（检材载体用一次性注射器挤压后去除），13,000rpm离心3分钟，去上清，每管加1.4ml纯水，振荡，13000rpm离心3分钟。洗三次后，移入0.5ml离心管中，13000rpm离心3分钟，弃上清。3)向沉淀物的离心管中加入200μl5％的Chelex-100（可根据检材量的多少进行调节），4μl5mg/ml的PK酶及8μl1M的DTT（PK酶及DTT的终浓度分别为100μg/ml和0.039M），振荡后56℃保温过夜。次日取出振荡，100℃保温8分钟，振荡，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。4．含有唾液斑的检材1)唾液斑：处理方法与血斑的处理方法相同。2)烟头：用镊子夹住烟头，剪刀剪下烟头外圈的纸，剪碎后放入0.5ml离心管中，加人500μl纯水，剧烈振荡，13000rpm离心3分钟，弃上清，加入100μl5％的Chelex-100，放入56℃保温30分钟以上。取出振荡，100℃保温8分钟，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。3)口香糖：将口香糖剪碎后放入0.5ml离心管中，加人500μl纯水，剧烈振荡，13000rpm离心3分钟，弃上清，加入100μl5％的Chelex-100，放入56℃保温30分钟以上。取出振荡，100℃保温8分钟，振荡，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。5．毛根用镊子夹住毛发的根部，剪去其余部分，将毛根放入0.5ml离心管中（处理毛发时很容易遗失，应小心操作，最好在桌面上铺一张白纸。），加人纯水洗一次，然后加入30μl5％的Chelex-100和2μl5mg/ml的PK酶，放入56℃保温6小时以上。取出振荡，100℃保温8分钟，振荡，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。6．肌肉与脑组织取小米粒大小的肌肉或脑组织，放入0.5ml离心管中，加人纯水洗一次，然后加入200μl5％的Chelex-100和5μl5mg/ml的PK酶，放入56℃保温3小时以上。取出振荡，100℃保温8分钟，振荡，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。