酸性磷酸酶显示方法的研究.doc

鸡肝酸性磷酸酶显示方法的研究
酸性磷酸酶(acidphosphataseACP)是指一组非特异性磷酸酯酶，在酸性条件下能水解各种磷酸脂。ACP分布广泛，它能够催化磷酸单酯键的水解并释放无机磷酸，是生物磷代谢的重要酶类，ACP活性的高低与人和动物的病理状态密切相关。酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶。溶酶体作为细胞内起消化功能的细胞器，含有大量酸性水解酶，在细胞内外物质代谢过程中起着十分重要的作用。ACP的活性变化直接体现溶酶体的功能状态[1]。在大部分组织中，它主要定位于溶酶体内。在溶酶体膜完整时，底物不易渗入，ACP活力微弱或无活性。经固定后，在合适的pH条件下，膜本身变得不稳定，逐渐改变其渗透性，底物可以渗入，酶活力被显示。此酶在pH5.0的环境中发生作用，分解磷酸脂而释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅。但因其是无色的，所以再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布[2]。
国内外也发布不少有关酸性磷酸酶在细胞中的定位研究的报道，例如：石长应等[3]已经利用电镜酶细胞化学方法，对大尾柱虫(Urostylngrandis)、冠突伪尾柱虫(Pseudorostyldcristata)、魏氏拟尾柱(Paraurostylaweissei)三种纤毛虫细胞内的酸性磷酸酶进行了定位观察。发现在它们体内ACPase的阳性反应颗粒除分布在消化腔隙内独立的泡状结构上和被消化的食物组织中外，在细胞质中的小圆泡内也有分布。近年来研究人员应用超微结构酶细胞化学技术研究了家蚕幼虫中肠ACPase活性的亚细胞分布[4]，结果表明ACPase主要分布在圆筒形细胞的细胞核内，核周围的内质网及溶酶体中，杯形细胞的细胞核，细胞底部的内褶膜上也有少量的酶活性存在。采用酶组织化学方法，孙建梅等[5]首次报道了ACP在文昌鱼组织中分布。ACP在文昌鱼组织中分布广泛，在表皮、消化道及生殖腺中均有分布。
但对于鸡肝酸性磷酸酶显示的研究却很少。肝脏它集有消化、合成、贮存、解毒、免疫等多种功能。鸡如果发生疾病，首先受到损害的是肝脏，肝脏就会出现一些特征性的病理变化[6]。因此，可以通过酸性磷酸酶显示的方法能测定鸡肝中磷酸酶的含量，来判定鸡的生理状态。本实验采用Gomori法（硝酸铅法）定性的显示鸡肝细胞中酸性磷酸酶，旨在为大学细胞生物学实验酸性磷酸酶的显示方法提供依据。
1．材料与方法
1.1材料
1.1.1试验鸡肝在实验室邻近市场购买新鲜鸡肝，装入预备的生理盐水中，并尽快送往实验室。
1.1.2主要试剂10%中性福尔马林(pH6.8～7.1)；酸性磷酸酶作用液；2%硫化胺溶液；0.05mol/L乙酸缓冲液(pH4.8)；0.8%生理盐水。
1.1.3试验仪器数码互动显微镜MoticBA200、低速离心机、恒温水浴锅、冰箱、注射器(5mL)、中号离心管、载玻片、手术刀、剪刀等。
1．2方法
1.2．1试验试剂的配制酸性磷酸酶作用液（临用时现配）；福尔马林固定液；
0.05mol/L乙酸缓冲液；2%硫化胺溶液（临用时现配）[7]。
1.2.2试验材料处理用生理盐水清洗购买的鸡肝，剪去结缔组织及杂物。称取鸡肝35g于培养皿中，剪成小块后用手术刀剁碎，加入30mL生理盐水，混匀。用注射器吸取鸡肝悬液，分在两支离心管中，每支各10mL，以500r/min离心3min。取上清液1-2滴滴在预冷的玻片上，涂片，将玻片垂直放入玻片架上。将样品迅速放到4℃冰箱内，让细胞自行铺展5-10min。
1.2.3酸性磷酸酶的显示将玻片浸入酸性磷酸酶作用液，在水浴锅中37℃孵育30min。蒸馏水漂洗。10%福尔马林(pH6.8～7.1)固定5min。蒸馏水洗1min。2%硫化铵处理3-5min。蒸馏水漂洗，甩干。在显微镜下观察。
1.2.4对照组的处理对照组1：固定时10%的中性福尔马林液4℃冰箱内固定2min，其余步骤同上；对照组2:染色时用硫化铵染色1min，其余步骤同上。
2．结果与分析
在数码互动显微镜下分别对实验组和对照组观察结果见图1。

AB

EF

图1鸡肝酸性磷酸酶显示结果
图A-图D分别显示试验组酸性磷酸酶在数码互动显微镜40倍、100倍、400倍、1000倍下观察结果；图E、F分别为对照组1、2酸性磷酸酶在数码互动显微镜1000倍下观察结果。
由图1A-D可知，在40倍、100倍、400倍和1000倍显微镜下，试验组鸡肝细胞内可见明显的黑色或棕黑色沉淀，即酸性磷酸酶的活性部位。即鸡肝细胞酸性磷酸酶作用液37℃孵育30min，10%福尔马林固定5min，2%硫化铵处理3-5min时，固定的细胞较多，染色效果较好。对照组1在10%的中性福尔马林液中固定2min，由于固定