实验七 鸡大肠杆菌灭活疫苗的.pdf

实验十一鸡大肠杆菌灭活疫苗的制备和检验

细菌性灭活疫苗制备的基本程序为菌种的选择和种子的生产、菌

液培养、灭活、配苗和分装，在此过程中还包括菌种、半成品以及成

品检验。

大量生产的细菌培养方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、

液体深层通气培养法、透析培养法及连续培养法等。灭活菌苗通常根

据细菌的特性加入最有效的灭活剂，采取最适当的灭活条件进行。灭

活疫苗的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。鸡大肠杆菌灭活菌通

常采用司盘白油佐剂，经过乳化而成。

一、目的要求

1、了解细菌性灭活疫苗制造和检验的基本原理和过程。

2、掌握种子的生产、菌液培养、灭活、配苗和半成品以及成

品检验方法。

二、材料与试剂

1．材料

(1)菌种：鸡大肠杆菌灭活疫苗菌种或临床分离株。

(2)实验动物：1～4月龄健康鸡。

(3)主要器材：超净工作台、恒温培养箱、冰箱、摇床、胶体

磨、压盖机、高压锅、显微镜、酒精灯、温度计、普通试管、三角瓶、

平皿、1ml注射器、疫苗瓶、瓶盖、记号笔和SPF鸡隔离箱等。

2．试剂蛋白胨营养琼脂培养基、普通肉汤培养基、甲醛溶液、

鉴别培养基、甲醛溶液、佐剂等。

三、实验内容

1、大肠杆菌培养与细菌的灭活。

2、大肠杆菌油乳剂灭活疫苗的配制。

3、大肠杆菌油乳剂灭活疫苗的成品检验方法。

四、操作步骤

1．大肠杆菌茵液培养

(1)种子液：将大肠杆菌菌种或临床分离株，分别于普通肉汤培

养基中，置36～37℃保温18～24h，经纯检验后作为种子液。

(2)细菌培养：将种子液接于蛋白胨营养琼脂培养基表面，36～

37℃保温24h。加适量灭菌生理盐水将细菌洗下，装入玻瓶中，充分

振荡菌液，使细菌分散开。

(3)纯检：将培养的细菌菌液接种于琼脂培养基表面，36～37℃

保温24h。观察菌落大小，应均匀一致。

(4)细菌计数：用麦氏比浊管法测定菌数或用平板计数，将菌数

调整为15亿个／ml。

2．细茵灭活按菌液体积加入终浓度为O．3％的甲醛溶液，于37℃

温箱中灭活24h，其振荡数次。灭活后取少量菌液，接种于普通营养

琼脂平板，37℃培养24～48h，进行灭活检验。菌液灭活后应无菌生

长。

3．配苗

（1)油苗

①油相准备：白油94份，硬脂酸铝2份，加热使硬脂酸铝溶化

后，加司本一806份，110℃加热30min。

②水相准备：菌液96份，吐温一804份，充分振荡，使吐温完

全溶解。

③乳化：加入油相1份，开动胶体磨，慢速转动，徐徐加入水相

l份，7000～10000r／min离心5min。

（2)铝胶苗

将灭菌好的铝胶按20%加入菌液，震荡均匀即可。

4．成品检验

(1)无菌检验：将成品直接接种T．G小管、G．A斜面或适于本

菌生长的融他培养基各2支，每支0.2ml，1支置37℃培养，1支置25℃

培养。另取0.2ml接种1支G．P小管，置25℃培养。均培养5d，应无菌

生长。

(2)安全检验：用1～4月龄健康鸡4只，各皮下注射lml，注射

后允许有轻微精神不振或食欲减退，但应在48h内恢复，均应健康活

泼。

(3)效力检验：用3～6月龄健康易感鸡8只，各颈部皮下注射疫

苗lml，3～4周后，连同条件相同的对照组鸡8只，各肌肉注射致死量

强毒菌液，观察14d对照组鸡全部死亡免疫组鸡至少保护6只。

五、思考题

1、大肠杆菌大量培养应注意什么问题?灭活后为什么必须进行灭

活检验?

2、大肠杆菌灭活疫苗成品检验包含哪些内容?效力检验应注意哪

些问题?