转氨酶、硝态氮、铵态氮等测定方法.doc

六、氮含量（硝酸盐、亚硝酸盐、游离氨基酸、铵态氮等）的测定：（2g）
样品提取液的提取:称取新鲜植物组织2g，加入15ml无离子水研磨成匀浆，置于45℃振荡机中摇动浸提（或超声波）lh后用5ml无离子水冲洗干净，然后离心或过滤(如含色素需用活性炭脱色)，滤液备用。
备注（lg的经验）：可溶性糖、可溶性蛋白质、VC等需要研磨提取的简单指标也可以使用此提取液按比例测定。

1硝态氮的测定：
标准氮试剂：精称KNO30.9021g，溶于少量重蒸无离子水中，并定容至250ml，含N量为500µgNO3一N／ml。
5％水杨酸一硫酸溶液：称取水杨酸5g，溶于100ml浓H2SO4(比重1．84)中，搅拌溶解后贮于棕色瓶内，冰箱中至多保存l周，最好现用现配。
2mol／LNaOH溶液：称取NaOH80g放入500ml硬质烧杯中，加入重蒸无离子水200ml，溶解后定容至l000ml。
操作方法
标准曲线制作取：50ml容量瓶6只(编号)，依次加入标准氮试剂5、l0、l5、20、25、30ml，用无离子水定容，则成为50、100、l50、200、250、300ug／ml的氮系列标准溶液；再取干沽50ml三角瓶7只，分别装入上述系列溶液0．2ml，剩下的1只三角瓶加入无离水0.2ml(作为O点)；然后分别加入5％水杨酸一硫酸溶液0.8ml，混匀静置20--30min(显色)；最后加入2mol／LNaOH溶液l9ml，混匀。冷却后利用751分光光度计，于410nm下比色，记录光密度(OD)值；并以OD值为纵座标，以标准氮(0、50、l00、150、200、250、300ug)为横座标，绘制一条标准曲线(通过原点的直线)。
0.1ml滤液＋0.4ml5％水杨酸一硫酸溶液，混匀静置20--30min(显色)；最后加入2mol／LNaOH溶液9.5ml，混匀。冷却后利用751分光光度计，于410nm下比色，记录光密度(OD)值；结果计算
按照公式A=CV1/(WV2)计算。
式中：A—NO3一N含量(ug／g)；W一样品重(g)；V1一样品提取液总量(m1)：V2一样品反应液数量(m1)；C一样品在标准曲线上查得的N量(ug)：
2亚硝态氮的测定：
NaN02标准溶液：精称分析纯NaNO20.24643g，以无离子水溶解并定容至50ml,再吸取此溶液5ml定容至l000ml，作为母液，其浓度为5µgNO2一N／ml。
磺胺试剂：称取分析纯磺胺(或对氨基苯磺酸)l0g，加浓HCI250ml(需用水浴加热溶解)，用无离子水定容至lL。
ɑ一萘胺试剂：称取分析纯ɑ一萘胺2g，加浓HCI250ml，溶解后定容至1L。
操作方法
标准曲线绘制：取干沽试管6支(0～5号)，依次加入标准NaNO2母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，再依次加入无离子水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml：摇匀后再在各管分别加入磺胺试剂和ɑ一萘胺试剂各2ml：摇匀后于35"(2水浴中显色30min，于520ml处比色，绘制出标准曲线。
lml样品提取液＋2ml磺胺试剂＋2mlɑ一萘胺试剂，摇匀后于35℃水浴中显色30min，于520ml处比色。
结果计算
按照公式A=CV/W计算。
式中：A—N02一N含量(µg/g)：
C一查标准曲线值(µg)；
v一样品提取液总量(ml)；
W一样品重(g)

3游离氨基酸态氮的测定：
试剂：（1）乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）：称取乙酸钠54.4g放入100ml烧杯，加无氨蒸馏水到60ml刻度，水浴锅加热搅拌溶解。冷却后转入100ml容量瓶中加30ml冰醋酸，再用无氨蒸馏水稀释至100ml。
（2）水合茚三酮试剂：称取3.0g再结晶的茚三酮置烧杯中，加入75ml正丙醇，搅拌使其溶解。再加入150ml正丁醇及300ml乙二醇，最后加入45mlpH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，置4℃下保存备用，10天内有效。
（3）标准氨基酸：称取80℃下烘干的亮氨酸46.8mg，溶于少量10%异丙醇中，用10%异丙醇定容至100ml。取此液5ml，用蒸馏水稀释至50ml，即为含5μg/ml氨基氮的标准液。
（4）0.1%抗坏血酸：称取50mg抗坏血酸，溶于50ml无氨蒸馏水中，随配随用。
（5）10%乙酸。
样品制备
取新鲜植物样品，洗净，擦干并剪碎。混匀后，迅速称取0.5-1.0g，于研钵中加入5ml10%乙酸，研磨匀浆后，用蒸馏水稀释至100ml。混匀，并用滤纸过滤到三角瓶中备用。
制作标准曲线
取6支20ml刻度试管，按表操作

加完试剂后混匀，盖上大小合适的玻璃球，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而退去，进而呈蓝紫色时，加60%乙醇4.9ml。