DNA分子机器.doc

AnAutonomousBio-bar-codeDNAMachineforExponentialDNAAmplificationandItsApplicationtotheElectrochemicalDeterminationofAdenosineTriphosphate.Chem.Euro.J.

自动的指数倍放大DNA的DNA分子机器及其
在三磷酸腺苷电化学分析中的应用

前言
经过几十亿年的自然进化，DNA已成为性能极佳的生物分子。它不仅承载了几乎所有生物的遗传信息，是生物不断繁衍所必需的遗传物质，也将成为材料科学和纳米技术研究中最有前途的生物功能分子。DNA的独特功能来自于它的组成、结构以及物理和化学性质。A-T和G-C沃森-克里克氢键相互作用的特异性，使我们可以根据需要设计DNA的序列和结构。酶是一类能在温和条件下高效催化各种生物化学反应的生物分子。不同的酶的功能亦各不相同，例如，连接酶可实现DNA链的连接；聚合酶能够按照模板DNA复制双链；切刻酶能够催化DNA特定序列区发生裂分；而端粒酶可实现单链DNA的延长。将DNA与各种不同的酶共同作用，可设计出能够模拟机器功能的纳米结构，即DNA分子机器。到目前为止，DNA分子机器的研究已取得很大进展，开发出了功能多样的DNA分子机器，可模拟镊子[1,2]、齿轮[3]、步行者[4,5]、DNA逻辑门[6]、信号放大型生物传感器[7-10]以及其他更多系统的功能。Willner科研团队将切刻酶、聚合酶和具有特定序列的DNA共同作用组成DNA分子机器，合成出大量的HRP拟酶序列作为检测的信号，该机器可用于DNA[7,8]，适体小分子[9]以及金属离子[10]的检测。然而，作为信号放大型的生物传感器，这些方法的放大效率仍然有限，研制放大效率更高的DNA分子机器，如指数倍信号放大的DNA分子机器，将更具有竞争力和应用潜力。
本文研制了一种新的可自动运行的信号放大型DNA分子机器，可完成DNA的指数倍放大。它是利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段的聚合作用驱动反应进行，实现信号转换，并输出指数倍放大的DNA。再用夹心法捕获这些DNA，并与DNA桥接Au纳米粒子负载CuS纳米粒子的多极放大探针杂交，将输出的DNA转换为电化学信号，用灵敏的差分脉冲伏安法（DPASV）进行检测。另外，该DNA分子机器不仅可用于DNA的放大检测，与适体识别元素相结合，可进一步用于适体小分子的电化学放大检测。本文以三磷酸腺苷（ATP）为模板分子，考察了这种新型DNA分子机器的性能，并实现了癌细胞中ATP的检测。总之，这种新型DNA机器结构简单，可自动化运行且信号放大效率高。通过改变DNA序列，更可应用到多种适体小分子的检测中，具有潜在的应用价值。
试验方法
试剂大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，脱氧核糖核苷酸（dNTPs）及所有DNA链（见表1）均购于赛百盛基因技术有限公司。三磷酸腺苷，三磷酸胞苷（CTP），三磷酸鸟苷（GTP），三磷酸尿苷（UTP），牛血清白蛋白（BSA），氯金酸，巯基乙酸，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐（TCEP）和乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDC）均购于美国Sigma公司。羧基化磁珠（MBs；粒径：1.0~2.0µm）购于天津倍思乐色谱技术开发中心。氯化汞（HgCl2），五水硫酸铜（CuSO4·5H2O），柠檬酸三钠和咪唑购于远洋试剂公司。试验用所有试剂均为分析级，试验用水为二次蒸馏水。
表1试验中所用DNA序列
NameSequencesATP-bindingaptamer(S1)5’-NH2-AAGAGAGGGACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’Primer1(S2)5’-ACTCCCCCAGGT-3’Primer2(S3)5’-GTGTCGTGAGATACCTCT-3’Primer1’(S4)5’-GACATTACTCCCCCAGGT-3’ReporterDNA(S5)5’-GGCCTAGTCCTGTTCCTCCGCAAT-3’Template1(S6)5’-ATCTCACGACACTGTATCTCACGACACTGTATCTCACGACACTGTATCTCACGACACTGTACCTGGGGGAGTTTTTTT-NH2-3’Template2(S7)5’-CAGGACTAGGCCTTTCAGGACTAGGCCTTTGGGAGTAATGTCTTTGGGAGTAATGTCTTTAGAGGTATCTCATTTTTT-NH2-3’CaptureDNA(S8)5’-NH2-ATTGCGGAGGAA-3’Bridgechain1(S9)5’-CAGGACTAGGCCGGGTTAATTTTTGGGTTTCAGTGT