CN2021114552642一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN114134169A
(43)申请公布日2022.03.04
(21)申请号202111455264.2C12Q1/6895(2018.01)

(22)申请日2021.12.01
(71)申请人云南省烟草农业科学研究院
地址650021云南省昆明市五华区圆通街
33号
(72)发明人王丙武赵璐高玉龙宋中邦
孔光辉王亚辉隋学艺张谊寒
焦芳婵吴兴富李永平贺晓辉
(74)专利代理机构上海精晟知识产权代理有限
公司31253
代理人胡晗
(51)Int.Cl.
C12N15/82(2006.01)
A01H5/06(2018.01)
A01H6/82(2018.01)
权利要求书2页说明书9页附图2页
(54)发明名称
一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法
(57)摘要
本发明公开了一种烟草毛状根遗传转化体
系的建立方法，包括烟草种子消毒获得无菌烟草
种子、烟草种子萌发获得烟草无菌苗、农杆菌制
备、农杆菌侵染液的制备、侵染、共培养、除菌培
养、筛选培养获得可用于基因功能检测的烟草毛
状根和毛状根鉴定等步骤。本发明简单易行、周
期短，8周即可获得足量毛状根，获得的毛状根可
应用于烟草基因的功能鉴定(包括被转化基因表
达量的检测；其他目标基因表达量的检测以及烟
碱、去甲烟碱、新烟碱等烟草物质含量的检测
等)；解决了传统烟草稳定植株转化从遗传转化
至可用于基因功能鉴定的T1代植株需时较长，大
约1年左右的时间的技术问题；比较而言，本烟草
毛状根遗传转化体系显著缩短了研究周期。
CN114134169A
CN114134169A权利要求书1/2页

1.一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：烟草种子消毒：用75％酒精浸湿烟草种子60～70s，弃酒精；再用50％v/v的次氯酸
钠震荡消毒9～11min，最后用无菌水冲洗5～6次，获得无菌烟草种子；
S2：烟草种子萌发：将步骤S1中的无菌烟草种子接种于MS培养基中暗培养2天后放置于
光照培养箱中直至无菌烟草种子萌发，待萌发1周后将烟草幼苗移栽至无菌培养瓶中继续
培养2～8周，获得烟草无菌苗；
S3：农杆菌制备：将测序验证正确的重组质粒转化进入农杆菌感受态细胞，涂布在含卡
那霉素和利福平的LB平板上28℃生长2～3天后，进行菌落PCR检测，鉴定出阳性菌斑；
S4：农杆菌侵染液的制备：将步骤S3中鉴定出的阳性菌斑克隆后接菌于含有卡那霉素
和利福平的MS培养基中，并于28℃、220rpm振荡培养至菌液浓度达到OD＝0.6时，向菌液中
加入乙酰丁香酮至终浓度为100μM并继续培养；当培养至OD600达0.8时，将菌液3000rpm离
心10min，弃上清液，用重悬液重悬菌体至OD600＝0.6,获得农杆菌侵染液备用；
S5:侵染:取步骤S2中烟草无菌苗的叶片，切至0.5cm*0.5cm大小，用步骤S4中的农杆菌
侵染液浸泡19～21min；侵染后，从侵染液中取出叶片，将所述叶片置于两层无菌滤纸中吸
干侵染液；
S6:共培养：制备表面具有无菌滤纸的共培养基，待步骤S5中的叶片表面菌液干透后，
将叶片置于无菌滤纸上，暗培养3天；
S7:除菌培养：将步骤S6中暗培养3天后的叶片转移至除菌培养基上，暗培养2周直至叶
片生长出5～6cm的毛状根；
S8：筛选培养：将步骤S7中的毛状根剪下置于固体筛选培养基上，培养1周；选择生长最
快的毛状根接种于液体筛选培养基中70r/min摇培2周，获得可用于基因功能检测的烟草毛
状根；
S9：毛状根鉴定：取步骤S8中的可用于基因功能检测的烟草毛状根，提取其DNA进行GUS
基因的PCR鉴定。
2.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S2
中，所述MS培养基为：2/3MS2.95g/L，Sucrose20g/L，Agrose8g/L，pH：5.8；所述光照培养
箱中，在25℃条件下，每天光照培养6小时，每天黑暗培养18小时。
3.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S3
中，所述测序验证正确的重组质粒为pCAMBIA1305.1‑GUS；所述重组质粒转化进入农杆菌
LBA9402感受态细胞采用的方法优选为冻融法。
4.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S3
中，所述农杆菌为LBA9402、K599、R1061中的一种。
5.根据权利要求4所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S3
中，所述农杆菌优选为LBA9402。
6.根据权利要求1所述的烟草毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤S4
中，所述重悬液优选为2/3MS2.95g/