孕妇外周血胎儿有核红细胞在产前诊断中的作用.doc

目前对遗传性疾病的产前诊断有数种方法。根据采样途径或诊断方法是否构成对胎儿的影响可分为侵入性产前诊断和非侵入性产前诊断。前者包括羊膜腔穿刺术、绒毛细胞吸取术及胎儿脐血穿刺等，虽然诊断精确度较高，但可导致流产等并发症，只能在高危孕妇中实施;后者的优点是既能行产前诊断又无危险性，适用于低风险的孕妇大群体筛选，尽早发现和杜绝异常胎儿，达到优生目的。许多学者致力于利用胎儿细胞进行产前诊断。利用孕妇外周血的胎儿细胞进行产前基因诊断三个关键性技术为:（1）证实母血中存在胎儿细胞和DNA。（2）建立可靠稳定的方法分离胎儿细胞和DNA。（3）应用灵敏性、特异性强的技术以微量胎儿细胞和DNA为模板诊断遗传性疾病。这是最具潜力的非侵入性产前诊断方法之一。

1孕妇外周血中胎儿细胞

正常胎盘并非是完善的、细胞透不过的屏障。在人类正常妊娠当中，进入母体血液循环中的胎儿血量估计是0.1～0.3ml。孕妇血中胎儿细胞的主要类型包括滋养叶细胞、淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、有核红细胞（NRBC）等［1］。其中最合适做产前诊断的胎儿细胞类型当首推胎儿有核红细胞，理由是:（1）胎儿有核红细胞是单核的，孕早期胎儿血中含量丰富但孕妇外周血中罕见;（2）其表达几种特异的抗原如运铁蛋白受体和特异的胎儿血红蛋白肽链如α链、β链和γ链，作为细胞标记而利于细胞的分类、鉴定和聚集;（3）其在孕妇外周血中的生存期短，不会持续到下一次妊娠［2］。

胎儿有核红细胞在早孕时就在母体血中出现，随着妊娠的进展而有所变化。在不同阶段，在母体血中所能检出胎儿有核红细胞的量亦不同。陈汉平等运用流式细胞术对61例孕11～34周，21～35岁的孕妇外周血中的胎儿细胞进行分析，结果显示在早、中、晚期妊娠时母血中都存在NRBC，孕早期NRBC含量随妊娠的进展呈上升趋势，17、18周左右达高峰，此后成下降趋势。并提出孕17、18周左右为产前诊断的最佳时间［3］。在分娩后2个月即不能检出，其中大部分在产后2h就不能测出，这表明检测过程较少受到上次妊娠遗留的胎儿DNA的假阳性的影响［4］。

Ri等应用PCR法扩增了17例孕妇外周血中的单拷贝Y染色体DNA序列，在所有怀有男性胎儿的7例孕妇中，均检测出Y染色体特异性DNA序列。并证实最早的检出时间为37天，而且在第7周检测出80%，在第9周检测出100%。也对其他31例孕妇在她们进行侵入性产前诊断之前行外周血Y染色体SRY基因检测，13例怀有男性胎儿的孕妇外周血中均检测出Y染色体SRY基因，而在18例怀有女性胎儿的孕妇外周血中均未检出［5］。

2孕妇外周血中胎儿有核红细胞的富集及遗传物质的提取

孕妇血有核红细胞（NRBC）含量极少，大约每1ml母血中只含5～20个胎儿细胞，NRBC更少，为每1ml含2～6个［1］胎儿细胞，必须进行分离纯化才能利于进一步分析，做产前诊断。

目前，分离胎儿细胞有多种手段，主要包括密度梯度离心、磁激活细胞分类（MACS）、荧光激活细胞分类（FACS）、选择性细胞培养技术、尼龙毛柱分离法、单独溶解红细胞法等。其中密度梯度离心法是根据母血细胞与胎儿细胞的体积和内部结构等存在较大差异而推测出它们的密度也可能存在较大差异而设计的［6］。张振洪等10例孕妇外周血采用密度梯度离心法富集胎儿细胞，在性别为男性的6例中，SRY基因绝大部分是在中层细胞中扩增出来的，这提示母血中胎儿细胞大部分集中在密度梯度离心后的中层细胞里。密度梯度离心法分离出来的细胞丢失少、形态完整，但是富集的胎儿细胞纯度与产量均不够。还应改进技术如采用多重密度梯度离心以提高纯度［7］。荧光激活细胞分类（FACS）法也是较常用的，分选CD71+细胞，富集的胎儿细胞纯度与产量均较高，但操作步骤复杂可能导致细胞丢失;CD71并非专一与NRBC结合，CD71+细胞不一定是NRBC;而且所选NRBC形态略有改变，细胞膜欠完整，也会给产前诊断技术带来困难［8］。磁激活细胞分类（MACS）也是可行的。该技术的特点是在较短时间里获得较多的靶细胞，且分离后的细胞仍有活性，可供培养和流式细胞分析等。Holzgreve等利用MACS对100例孕20周左右的孕妇的外周血进行富集分离，而后进行染色体分析，检测出10例非整倍体的胎儿，而后进行羊水穿刺染色体分析，符合率为100%［9］。

胎儿细胞分离后应提取胎儿遗传物质，在此基础上进行遗传病的基因诊断。Lo等首次应用煮沸法提取DNA，用PCR扩增胎儿特异性Y序列，通过电泳检测［10］。Houfflin等比较了单纯煮沸法和加用酚/氯仿的方法提取胎儿DNA，发现后者可以提高提取胎儿DNA的浓度，敏感性由50%提高到80%［11］。陈小蔓等后来应用酚提取法纯化孕妇血浆及血清胎儿游离DNA，证实了Houfflin等的结论［12］。Sekizawa等首次用