RNA提取方法及原理.ppt

RNA提取方法及原理1、研究背景1.2RNA分布2、方法及原理RNA提取流程－－样品前处理注意点RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNARNA提取流程－－RNA的纯化及获得2.2RNA提取的注意事项

2.2.1杜绝外源酶的污染
一：严格戴好口罩，手套。
二：实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。
三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。
2.2.2阻止内源酶的活性
一：选择合适的匀浆方法。
二：选择合适的裂解液。
三：控制好样品的起始量。2.3Rnase污染的10大来源
1：手指头
2：枪头
3：水/缓冲液
4：实验台面
5：内源Rnase
6：RNA样品
7：质粒抽提
8：RNA保存
9：阳离子(Ca,Mg)
10：后续实验所用的酶
2.4几种RNA提取方法

2.4.1TRIzol法
TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。TRIzol法提取流程

1．样品处理：（１）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。（２）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置５min。
2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。
3．4℃离心，12000g×15min，取上清。
4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。
6．加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。
7.晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。细胞
2.4.2苯酚法

细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。
苯酚法提取酵母RNA

取1g活性干酵母在研钵中研碎，加10mLSDS-缓冲液使成匀浆，洗入各Eppendorf管（略少于管容积的一半），加溶菌酶0.1mL，混匀，室温静置10min，再加等体积饱和酚液，室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层，在0-4℃低温环境下，10000r/min离心10min。吸出上层清液，转入新的Eppendorf管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min，然后10000r/min离心5min。吸出上层清液，转入另一新Eppendorf管，加2倍体积95％乙醇（含2％乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA沉淀。再以10000r/min离心5min，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各1min，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。

2.4.3异硫氰酸胍—酚法

异硫氰酸胍—酚法提取RNA的原理如下：GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库。异硫氰酸胍—酚法提取植物组织总RNA

1）取2g左右植物组织放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状。加4－5mL异硫氰酸胍溶液。转移到小离心管中，每管0.5mL。
2）置于冰上，顺序加入：50μl2mol/LNaAc,混匀，0.5mL水饱和酚，170μlCI，混匀。置冰上15min。
3）各管平衡后，4℃,12000g离心20-30min。转移上清到另一管中，加入等体积的异丙醇，混匀，－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉淀10min。4℃,12000g离心20min回收RNA。
4）用70％乙醇洗一次，4℃，12000g离心5min。吸去乙醇，空气中吹干RNA沉淀。用150μl异硫氰酸胍溶液，65℃吹打RNA沉淀溶解。5）加等体积异丙醇－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉淀10min。4℃,12000g离心2