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磁珠法纯化DNA原理

磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种
官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁（MagneticSilicaParticle）就是指磁珠微
珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离
心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如DEAE，COOH）
等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。
使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集
或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法
核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有’Mag-Bind’。

核酸分离与纯化的原则
核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、
脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整
性;排除其他分子污染。

核酸分离与纯化的步骤
大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质
分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
1.细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学
作用、酶作用等方法实现。
(1)机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。
这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长
链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从<500bp～>20kb之间,而颗粒
匀浆法提取的核酸一般<10kb。
(2)化学作用:在一定的pH环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水
相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、TritonX-100、Tween20、NP-40、
CTAB、sar-cosyl、Chelex-100等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍)而获得。
而pH环境则由加入的强碱(NaOH)或缓冲液(TE、STE等)提供。在一定的pH环境
下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合
剂(EDTA等)可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+、Ca2+,从而抑制核酸酶的活
性,保护核酸不被降解。
(3)酶作用:主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)以使细
胞破裂,核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催
化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1,4)键水解。蛋白酶
K能催化水解多种多肽键,其在65℃及有EDTA、尿素(1～4mol/L)和去污剂(0.5%SDS
或1%TritonX-100)存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实
际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据
细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。

2.酶处理:在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解,以利于核酸的分离
与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K或链酶蛋白酶)可以降解蛋白质,灭活核酸酶
(DNase和RNase),DNase和RNase也用于去除不需要的核酸。

3.核酸的分离与纯化:核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子
物质更具亲水性,根据它们理化性质的差异,用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将
核酸分离、纯化。(1)酚提取/沉淀法:核酸分离的一个经典方法是酚∶氯仿抽提法。细胞裂
解后离心分离含核酸的水相,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1体积)混合液。
依据应用目的,两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸)或简单颠倒混匀(适用于分
离高分子量核酸)后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。
酚是一种有机溶剂,预先要用STE缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核
酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联;故在制备
酚饱和液时要加入82羟基喹咛,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提
高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过
沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、
氯仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入pH5.0～5.5终浓,度为0.3M的NaOAc
或KOAc后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然
后加入2～2.5倍体积的乙醇,经一定时间的孵育,可使核酸