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实验三高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定

一、实验目的

1、掌握微生物分离纯化的基本操作；
2、掌握用选择性培养基从环境中分离苯酚降解菌的原理和方法；
3、掌握微生物对酚降解能力的测定方法；
4、掌握4-氨基安替比林法测定苯酚含量的方法。
二、实验原理

在工业废水的生物处理中，对污染成分单一的有毒废水，可以选育特定的高
效菌株进行处理。这些高效菌株以有机污染物作为其生长所需的能源、碳源或氮
源，从而使有机污染物得以降解，具有处理效率高、耐受毒性强等优点。
苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体、土壤
中，会造成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。本实验通过筛选苯酚降
解菌来处理含酚废水，将苯酚降解为为二氧化碳和水，消除对环境的污染。

+
COOHCH2CH2COOHCH3COOH

CO2+H2O
从环境中采样后，在以苯酚为唯一碳源的培养基中，经富集培养、分离纯化、
降解实验和性能测定，可筛选出高效酚降解菌。
三、实验器材与试剂

1、样品
实验土样采自校园污水处理厂。
2、器材

恒温培养箱、恒温摇床、分光光度计、比色皿、试管、250mL三角瓶、100mL
容量瓶、培养皿、涂布玻棒、量筒、天平、灭菌锅、酒精灯、接种环、棉花、棉

线、牛皮纸、pH试纸。
3、试剂
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、苯酚、四硼酸钠（）、4-氨基安替比林、
Na2B4O7
过硫酸铵（（））、、、、琼脂。
NH42S2O8K2HPO4KH2PO4MgSO4
苯酚标准溶液：称取分析纯苯酚1.0g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，摇
匀。此溶液溶度为1000mg/L。测定标准曲线时将苯酚浓度稀释至100mg/L。
饱和溶液：称取，溶于蒸馏水中，冷却后使用，此
Na2B4O7Na2B4O740g1L
溶液的pH值为10.1。
3%4-氨基安替比林溶液：称取分析纯4-氨基安替比林3g，溶于蒸馏水中，
并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。
2%（）溶液：称取分析出（），溶于蒸馏水中，并稀
NH42S2O8NH42S2O82g
释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。
4、培养基
富集培养基：蛋白胨，，，水，调节
0.5gK2HPO40.1gMgSO40.05g1000mLpH
7.2-7.4，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。
基础培养基：，，，，，
K2HPO40.6gKH2PO40.4gNH4NO30.5gMgSO40.2gCaCl20.025g
水1000mL，调节pH7.0-7.5，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。
四、实验步骤

（一）富集培养和驯化

采集活性污泥或土样，接种于装有100mL富集培养基和玻璃珠并加有适量
苯酚（50mg/L）的三角瓶中，30℃振荡培养。待菌生长后，用无菌移液管吸取
1mL转至另一个装有100mL富集培养基和玻璃珠并加有适量苯酚的三角瓶中，
如此连续转接2-3次，每次所加的苯酚量适当增加，最后可得酚降解菌占绝对优
势的混合培养物。
（二）平板分离和纯化

1、用无菌移液管吸取经富集培养的混合液10mL，注入90mL无菌水中，充
分混匀，并继续稀释到适当浓度。
2、取适当浓度的稀释菌液，加一滴于固体平板（由富集培养基加入2%的琼

脂组成，倒平板时添加适量的苯酚，浓度达到200mg/L。）中央，用无菌玻璃涂
棒把滴加在平板上的菌液涂平，盖好皿盖，每个稀释度做2-3个重复。
3、室温放置一段时间，待接种菌液被培养基吸收后，倒置于30℃恒温箱中

培养2-3d。
4、挑选不同菌落形态，在含适量苯酚的固体平板上划线纯化。平板倒置于
30℃恒温箱中培养2-3d。
（三）转接斜面

将纯化后的单菌落转接至补加适量酚的试管斜面，30℃恒温箱中培养2-3d。
（四）降解实验

用接种环取斜面菌苔一环，接种于100mL基础培养基中，添加适量的苯酚，
30℃震荡培养2-3d。
（五）酚含量的测定

1、标准曲线的绘制：取100mL容量瓶7只，分别加入100mg/L苯酚标准溶
液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，，于每只容量瓶中加入饱和溶液
5.0mLNa2B4O7
，3%4-氨基安替比林溶液，再加入和溶液，2%（）
10mL1mLNa2B4O710mLNH4
，然后用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。放置后将溶液转至比色皿中，
2S2O81mL10min
在560nm处测定吸光度，根据吸光度和苯酚的量绘制标准曲线。
2、培养液中苯酚含量的测定：取经降解的培养液30mL，离心，取上清液
于容量瓶中，加入饱和溶液，3%4-氨基安替比林溶
10mL100mLNa2B4O710mL
液1，再加入饱和溶液，2%（），然后用蒸馏水
mLNa2B4O710mLNH42S2O8